一种禽用融合型口服干扰素表达藻体的制备及其应用

摘要

一种禽用融合型口服干扰素表达藻体的制备及其应用，利用禽类干扰素α、γ基因保守序列为基础，将具有较强抗病毒作用的干扰素α基因和能够提高机体免疫力、增强机体体质的干扰素γ基因融合表达，表达的α+γ融合干扰素兼有二者协同功能。同时，利用盐藻生物反应器作为表达系统，该系统除能表外源基因外，盐藻自身的营养丰富、无毒无害等优点也得以利用，制备得到“一株多用”的基因藻株，应用该转基因藻株制备出的禽用融合型口服干扰素表达藻体，可应用于禽类病毒性疾病的预防或治疗、禽类养殖业和相关饲料加工业等领域，效果好且绿色环保、成本低廉。

主权项

一种禽用融合型口服干扰素表达藻体的制备，其特征在于：其具体制备步骤如下：1）禽α、γ干扰素基因的制备：分别设计两对特异性引物：禽α干扰素基因引物序列为：上游引物：5’TCTAGAATGGCTGGGCCATCAGCCCC3’，下游引物：5’ GGATCCCGTGTTGGTGCGGGT 3’，下划线所指为上下游引物分别引入的Xba I和BamH I酶切位点；γ干扰素基因基因引物序列为：上游引物：5’GGATCCACTTGCACTACCCAGACTTAC3’，下游引物：5’ GAGCTCTTACGTGTTGGTGCGGGTGA 3’，下划线所指为上下游引物分别引入的BamHI和Sac I酶切位点，然后通过PCR的方法分别扩增出禽α干扰素基因和禽γ干扰素基因；禽α干扰素基因序列如序列表序列1所示，禽γ干扰素基因序列如序列表序列2所示；2）转化盐藻细胞真核表达载体构建：通过PCR扩增的禽α、γ干扰素基因片段分别与pMD18‑T克隆载体连接，通过各自的双酶切鉴定和测序鉴定后分别切下α、γ基因片段，通过T4连接酶先后将二者基因连接到pBI系列的真核表达载体上；将构建好的重组载体pBI‑α+γ用于对盐藻细胞的转化；3）重组表达载体转化盐藻细胞：将构建好的重组质粒通过玻璃珠转化法，或通过基因枪法、电击法、脂质体介导法或超声波导入法转化盐藻细胞；转化后的盐藻细胞经固体选择培养基筛选培养，最终获得阳性转化藻株；挑取阳性藻株进行扩大培养，供后续分子生物学鉴定所用；4）对转化藻株的筛选与分子生物学鉴定：提取转基因藻株的基因组总RNA，对整合到盐藻基因组中的目的基因进行RT‑PCR扩增鉴定，以期查明目的基因整合与表达状态，同时，利用western blot技术对表达得蛋白产物进行生化活性分析；5）禽用融合型口服干扰素表达藻体的制备： 将鉴定正确的转基因藻株按1%的接种量接种于天然海水藻类养殖池，进行开放式的规模化养殖，培养10‑14天，当藻细胞浓度达到106个/ml时，通过静止沉淀或离心收集藻体，即得到禽用融合型口服干扰素表达藻体。