去亲和层析纯化标签的基因重组七鳃鳗Lj-RGD3蛋白的制备方法

摘要

本发明公开一种操作简单、纯化率高的去亲和层析纯化标签的基因重组七鳃鳗Lj-RGD3蛋白rLj-RGD3（Tag-）的制备方法，构建了无任何纯化标签的重组表达载体pET23b-RGD3（Tag-），并将此重组质粒转化入表达菌中进行基因重组蛋白的表达，利用金属螯合离子亲和层析、阳离子交换、透析等，制备不带有任何亲和层析纯化标签的七鳃鳗Lj-RGD3基因重组蛋白，命名为rLj-RGD3（Tag-）蛋白，其蛋白纯度达到≥99%。

主权项

一种去亲和层析纯化标签的基因重组七鳃鳗Lj‑RGD3 蛋白的制备方法，其特征在于按照如下步骤进行：a. 在Lj‑RGD3基因序列3’末端引入终止密码子，与载体以Nde I和Hind III酶切位点相连接，转化入表达菌后进行阳性转化子的筛选鉴定；b. 对阳性重组子进行IPTG诱导表达；c. 对表达的重组蛋白进行提取；d. 对提取的蛋白依次按如下步骤进行纯化：d‑1．通过金属螯合离子亲和层析柱HiTrap IMAC HP进行蛋白纯化：将HiTrap IMAC HP柱连接到已经用20％乙醇冲洗好的BIO‑RAD仪器上，用10倍柱体积的蒸馏水对柱子进行润洗，润洗的过程中保持UV值稳定，初始值为0；用2.5倍柱体积的0.1M浓度的硫酸铜溶液走柱，再用10倍柱体积的蒸馏水冲洗柱子；用10倍柱体积的 Binding buffer平衡柱子，保持柱子UV值稳定，UV基线值为0；将提取的蛋白过柱，之后再用15倍柱体积的Binding buffer平衡柱子，再用Elution buffer洗脱目的蛋白，流速为1ml/min；收集洗脱液为1ml/管，回收第42~54管的样品，保存于‑20℃；所述的Binding buffer溶液成分由20mM 磷酸钠、0.5M氯化钠、5mM咪唑组成；所用的Elution buffer溶液成分由 20mM 磷酸钠、0.5M氯化钠、500mM咪唑组成；d‑2．对所收集的蛋白采用SP柱进行阳离子交换层析：将阳离子交换柱SP柱连接到BIO‑RAD仪器中，用灭菌水清洗柱子，流速为1ml/min，洗10个柱体积；用10倍柱体积的低盐缓冲液平衡柱子，流速为1ml/min，直至UV基线保持在稳定的水平上，初始值为0；将已收集的蛋白过SP柱，再用10倍柱体积的高盐缓冲液洗脱目的蛋白，流速为1ml/min；收集洗脱液为1ml/管，回收第26~34管的样品保存于‑20℃；所用的低盐缓冲液成分由 50mM Tris‑HCl和50mM NaCl 组成，所用的高盐缓冲液成分由50mM Tris‑HCl和1M NaCl组成； d‑3.透析：采用截留分子量为10 kDa的透析袋对上述经步骤d‑2纯化的蛋白进行4℃过夜透析，透析缓冲液为去离子水；d‑4. 冷冻干燥：将经步骤d‑3透析的蛋白经冷冻干燥，制备rLj‑RGD3（Tag‑）蛋白冻干粉。