| 主权项 |
一种基于弹回探针引物技术的低频突变检测方法，其特征在于，具体步骤为：步骤1, 设计弹回探针引物弹回探针引物是将探针序列添加在一条扩增引物序列5`端后形成的集探针和引物双重作用的核酸序列，在PCR扩增时,发挥引物5’‑3’延伸的作用；不对称PCR扩增后,形成产物单链结构,探针序列可以弹回与目标杂交序列结合,形成二级结构；（1）设计弹回探针引物序列时,先设计包含有待检测突变位点的特异性扩增引物,产物大小不超过300bp；（2）将覆盖突变位点的探针序列添加在相应一条扩增引物5`端,使得扩增之后形成的产物单条链,形成弹回蝎型结构；其中，使突变位点处于探针序列中间三个碱基的位置上；选择与野生型相匹配的探针；并且，在弹回探针引物探针末尾添加两个不互补配对碱基，以免弹回结构为3`端时,弹回探针引物中的探针部分会作为引物延伸； (3)采用不对称扩增的方式,上游高浓度引物为弹回探针引物,下游低浓度引物,称为限制引物,即为另一条未连探针的普通扩增引物；弹回探针引物和限制引物使用浓度比为10:1‑20:1； (4)在设计时,限制引物Tm值要比弹回探针引物Tm值高3℃‑5℃；（5）将扩增后形成的弹回结构碱基序列输入网页” The mfold web serve”—“DNAfolding form”碱基序列输入框中,在阳离子浓度为50mM,Mg2+浓度为3mM,折叠温度为55℃的条件下,确保扩增片段形成弹回蝎型结构，且二级结构形式单一；步骤2, 制备DNA模板使用QIAamp DNA Mini Kit, QIAamp blood DNA Midi Kit,细菌基因组DNA提取试剂盒分别抽提组织DNA,血浆DNA,细菌基因组DNA；步骤3, 配置检测体系检测体系中包含: 弹回探针引物和限制引物，还包括：1XPCR buffer，1xLC Green plus+ +,0.4 U TaKaRa Taq HS , DNA模板，ddH20；步骤4, 设置反应程序, 确定Ts值使用R℃he荧光定量PCR仪进行反应程序的设置，包括普通PCR扩增设置,富集扩增的设置,HRM检测程序的设置；富集扩增技术选择的延伸温度为低于野生型扩增产物单链弹回结构解链温度而高于突变型扩增产物单链弹回结构的解链温度；步骤5, 结果的判定Snager测序图以及HRM结果分析判断,LC480自带分析软件“Tm calling”分析。 |
