一种T-2毒素的生物合成方法

摘要

本发明属于兽医药理学技术领域，具体涉及一种T-2毒素的制备方法。以玉米颗粒为原料，经产毒镰刀菌复苏，产分生孢子，接种玉米产毒培养基培养，在产毒高峰期对培养基采用乙醇液提取、二氯甲烷萃取、一步柱层析和结晶等工艺过程，获得T-2毒素结晶的提取方法。整个提取效率可达89%，所得毒素经核磁和质谱结构鉴定正确无误，测定含量不低于95.66%，稳定性至少4个月以上。与传统提取工艺比较，本发明采用一步法柱层析即可分离纯化出大量T-2毒素，步骤简单快捷产量高，所制备的毒素性质稳定纯度高，整个提取方法极大的降低了毒素合成成本，简化了毒素合成工艺，合成的毒素可以广泛应用于毒理学、代谢实验等各种毒素相关科研领域。

主权项

一种T‑2毒素的生物合成方法，其特征在于如下步骤：（1）菌种的复苏和分省孢子悬液的制备拟分支孢镰刀菌的复苏：生产菌种为拟分支孢镰刀菌(Fusarium sporotrichioides Sherbakoff)T‑2，将该菌种的菌粉在2‑4mL无菌蒸馏水下室温复水一夜后，接种至马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，在15‑30℃下培养4‑8天；分生孢子悬液制备：取培养4‑8天的马铃薯葡萄糖琼脂培养基，挑取菌丝至分生孢子悬液培养基，于3000Lux光照下15‑30℃，200rpm摇床培养7‑9天；玉米产毒培养：将摇床培养7‑9天后的分生孢子液，接种至已经121℃1h，每天一次，灭菌两次后的玉米产毒培养基中，接种后放入15‑30℃黑暗培养，培养时每隔1天震荡培养基至玉米颗粒松散无大结块；（2）T‑2毒素的提取分离该步骤包括：固液萃取，液液萃取，柱层析和结晶；具体是：固液萃取：向培养15‑28天的玉米产毒培养基中按体积重量比15mL/g加入50‑70%乙醇水溶液，并搅拌均匀，浸泡静置1‑3天；液液萃取：将浸泡后的乙醇液采用中速定性滤纸抽滤，收集乙醇液；每1mL乙醇提取液在旋转蒸发仪上40‑60℃下旋转至100mL‑300mL，收集浑浊水相，按水相:二氯甲烷2:1（v/v）比例加入二氯甲烷萃取3次，收集二氯甲烷萃取液后，于30‑35℃下旋转蒸干，收集棕褐色色油状粗毒素；柱层析：每10g粗毒素用50‑200mL二氯甲烷溶解后按粗毒素:硅胶重量比1:40比例上样至顶部，采用石油醚丙酮体积比4:1作为洗脱液来进行洗脱，每隔30mL收集，并采用T‑2毒素化学对照品进行对照，收集含有T‑2毒素单一染色点部分，收集液在旋转蒸发仪下40‑60℃下旋转蒸干；结晶：将蒸干后的T‑2毒素加入少量分析纯丙酮溶解，加入分析纯正己烷至白色浑浊后，滴加丙酮至再次澄清透明，静置过夜，待白色晶析出，收集放入真空干燥器干燥，即获得纯度不低于95.6%的T‑2毒素结晶；其中：步骤（1）中所述的培养基按如下方法制备马铃薯葡萄糖琼琼脂培养基：马铃薯块200g，加600mL水煮10‑20分钟后，棉纱布过滤，得滤液，向滤液加琼脂20g，葡萄糖20g，溶解后补蒸馏水至1L，于121℃下灭菌15min；分生孢子悬液：羧甲基纤维素钠7.5g，磷酸二氢钾0.5g，酵母粉0.5g，硝酸铵0.5g，七水硫酸镁0.25g，加水1L并加热溶解后再用蒸馏水补至1L，于121℃高压蒸汽下灭菌15min；玉米产毒培养基：玉米100g，水100mL加入500mL锥形瓶浸泡过夜后，于121℃高压蒸汽下灭菌，每天一次，每次1h，灭菌两次。