甲型肝炎病毒抗原检测方法

摘要

本发明提供一种甲型肝炎病毒抗原检测方法。即采用长臂生物素标记HAV-IgG，以辣根过氧化物酶标记链霉亲和素作放大系统，对甲型肝炎病毒抗原进行检测时，由于长臂生物素比一般生物素有更长的间臂，能减少空间位阻，使几个生物素化分子能同时与一个亲和素复合物结合，加之长臂生物素为水溶性生物素，直接标记抗甲型肝炎病毒抗体可减少免疫检测中的步骤，缩短检测时间，即由通常的2天缩短为全程检测只需3.5小时，并可通过降低交叉反应而降低背景，提高检测灵敏度；另外，由于辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素与亲和素不同，其分子量大约为60000，不含碳水化合物，非特异性结合较亲和素低，所以具有提高灵敏度及特异性的效果。

主权项

一种甲型肝炎疫苗生产检定中对甲型肝炎病毒抗原进行检测的方法，其特征在于经过下列步骤： A、按50～150μl／孔的量，将待检甲型肝炎病毒抗原、抗原阳性对照和抗原阴性对照分别加入酶标板的孔中，并留空白调零孔，放入湿盒中，于37℃保温1～3小时后，洗板3～5次； B、按50～150μl／孔的量，在A步骤的酶标板的各孔中，加入稀释度为1：500～3000的长臂生物素标记HAV抗体使用液，放入湿盒中，于37℃保温0.5～1小时后洗板3～5次； C、按50～150μl／孔的量，在B步骤的酶标板的各孔中，加入稀释度为1：2000～10000的辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素使用液，放入湿盒中，于37℃保温0.5～1小时后洗板3～5次； D、在C步骤的酶标板的各孔中，分别加入TMB显色液A和B各50μl／孔，混匀，放入湿盒中，37℃保温10～15分钟； E、在D步骤的酶标板的各孔中，按50～100μl／孔的量加入终止液后置于酶标仪上，在450nm波长下，用空白孔调零后检测吸光度A值，即得检测结果； 所述B步骤的长臂生物素标记HAV抗体经下列方法制备： a、按长臂生物素：甲型肝炎病毒抗体=1：5～20克分子比的比例，将市购的长臂生物素用注射用水溶解后，与甲型肝炎病毒抗体混合，得混合体，于室温下放置0.5～1.0小时，或2～8℃温度下放置1～3小时； b、用磷酸盐缓冲液于2～8℃温度下透析上述a步骤的混合体并过夜，加等体积甘油混匀，得长臂生物素标记HAV抗体，‑20℃以下保存备用； 所述A步骤的酶标板预先经过下列方法制备： 1)酶标板包被：将纯化的HAV‑IgG用碳酸盐缓冲液稀释至5‑20μg／ml，按50～150μl／孔的量加入到聚苯乙烯板中，2～8℃过夜，洗板3～5次； 2)酶标板封闭：按150～250μl／孔的量加入封闭液，2～8℃过夜，对酶标板进行封闭，洗板3～5次，晾干，冰箱保存备用；所述磷酸盐缓冲液为PBS，洗液为PBS。