一种用于烟草花粉的诱变方法

摘要

本发明涉及一种用于烟草花粉的高效诱变方法。该方法是在无菌条件下获取烟草花粉并置于液体培养基中用浓度为0.1-0.2％的EMS在30-32℃的环境下避光诱变处理，再用NLN-16液体培养基在30-32℃避光环境下进行染色体加倍处理，之后置于NLN-13液体培养基中在24-26℃的环境下避光进行诱胚培养，待幼胚出现即可用24-26℃摇床避光振荡培养，最后出现子叶的胚置于固体培养基进行继代培养，移栽季节幼苗经炼苗后即可移栽入大田进行突变性状鉴定。本发明克服了基因表达上显隐性的障碍，有利于选择，且大大缩短了突变体性状稳定的周期，节省了育种时间；具有变异幅度大、诱变频率高等特点。

主权项

一种用于烟草花粉的诱变方法，其特征在于：所述方法依次按以下操作步骤进行：（1）样品采集：取烟株主花序或侧花序上健康的、花粉处于单核靠边期的适龄花蕾，迅速保存于冰盒；（2）消毒处理：在超净工作台上剥取花蕾中的花药，将取出的花药用无菌纱布或无菌市售丝袜装好浸入70‑75%浓度的乙醇中消毒10‑15s，再浸入饱和次氯酸钙溶液中浸泡8‑10min，最后用无菌水漂洗多次；（3）收集花粉：将步骤（2）中消毒处理后的花药放入圆底试管中，加入1‑3ml的B5‑13液体培养基，再加入1‑2ml用于软化花药壁的酶液，碾成匀浆，然后用装有300‑400目双层尼龙膜的漏斗进行过滤，并用离心管收集滤液，离心处理后去上清液，加B5‑13液体培养基重新悬浮，再次离心处理后去上清液；所述酶液为纤维素酶、果胶酶、蜗牛酶和水的混合液，酶液中纤维素酶、果胶酶和蜗牛酶浓度分别为0.6%、0.2%和0.5%；（4）诱变处理：将步骤（3）中经过两次离心处理后收集的花粉用B5‑13液体培养基悬浮，加入浓度为0.1‑0.2%的EMS溶液进行诱变处理，放入温度为30‑32℃的环境下避光培养8‑10h；（5）加倍处理：将步骤（4）中诱变处理后的花粉溶液移入离心管中离心8‑10min，离心处理后去上清液，再用含有浓度为45‑65mg/L秋水仙素的NLN‑16液体培养基悬浮后转入玻璃容器中，放置在温度 为30‑32℃的环境避光培养50‑70h，进行加倍处理；（6）诱胚培养：将步骤（5）中的加倍处理后的花粉溶液移入离心管中离心处理后去上清液，用NLN‑13液体培养基悬浮花粉，转入培养皿中，放置在温度为24‑26℃的环境下，进行避光诱胚培养14‑21d，待培养皿中出现幼胚，便将培养皿放置于转速为56‑65r/min的摇床内，在温度为24‑26℃环境下避光振荡培养6‑8d；（7）继代培养：将步骤（6）中培养皿内出现子叶的胚转移到MS固体培养基上，在温度为25‑27℃、日光照为8‑10h的环境中进行继代培养；（8）幼苗转植：对步骤（7）中继代培养的幼苗进行炼苗，将通过炼苗后的幼苗根部的培养基清洗干净，移栽到温室的花钵中假植或者直接栽种于大田中进行突变体鉴定；其中B5‑13液体培养基为B5基本培养基中蔗糖浓度为13%的液体培养基。