一种苦味酸天狼猩红染色法及其在筛选抗肝纤维化化合物中的应用

摘要

本发明属于生物技术领域，具体涉及利用胶原纤维的苦味酸天狼猩红染色法高通量筛选抗肝纤维化的有效化合物，所用细胞为肝星状细胞系CFSC-8B。转化生长因子TGF-β-1在剂量为10ng/mL，作用时间48h时可显著诱导CFSC-8B细胞分泌胶原，利用苦味酸天狼猩红染色法可有效检测TGF-β1诱导CFSC-8B细胞胶原的分泌。使用胶原纤维的苦味酸天狼猩红染色法筛选樟芝，灵芝，虫草头孢，虫草被孢，天麻蜜环和猴头菌粉不同极性提取物中具有抗肝纤维化活性的化合物，试验表明樟芝正己烷和氯仿提取物，虫草被孢乙酸乙酯提取物，天麻蜜环正己烷、氯仿、乙酸乙酯提取物可显著抑制TGF-β1诱导CFSC-8B细胞胶原的分泌，且具有剂量依赖关系，差异显著，具有抗肝纤维化作用，而其他提取物无显著性抑制效应。

主权项

一种苦味酸天狼猩红染色法,其特征如下：包括以下步骤：（1）将细胞传代后接种至96孔板，待细胞长至70‑80%时，0.5%FBS将细胞进行同步化处理24h，实验分为对照组及TGF‑β1刺激组，作用不同的时间；（2）用PBS润洗细胞三次，Bouin’s fluid 室温固定1h，吸弃固定液，培养板用PBS清洗三次（直到无黄色的固定液的颜色），无菌台空气干燥；（3）加入天狼猩红染色液，在摇床上震荡染色1h，26℃，100rpm；（4）吸弃染色液，0.01N HCL润洗细胞三次以除去没有与细胞胶原结合料；（5）用0.1N NaOH溶解与细胞结合的染料，在摇床上震荡溶解30min，26℃，100rpm；（6）用酶标仪检测OD540nm，以0.1N NaOH调零。