越野他汀的生物合成基因簇及其应用

摘要

本发明涉及越野他汀的生物合成基因簇，具体地，是由一种小单孢菌Micromonospora sp.TP-A0468产生的具有抗肿瘤活性的蒽环类抗生素——越野他汀的生物合成基因簇的克隆、测序、分析、功能研究及其应用。整个基因簇共包含55个基因：17个II型聚酮合成酶(PKS)相关基因；8个非核糖体聚肽合成酶(NRPS)相关基因；9个糖基合成相关基因；6个特殊的后修饰基因；7个抗性基因；5个调节基因以及3个无明确功能的基因。通过对上述生物合成基因的遗传操作可阻断越野他汀的生物合成，或使其产量发生改变，或产生新的化合物。该基因簇可用于蒽环类化合物的基因工程、蛋白表达、酶催化反应等，也可用于寻找和发现用于医药、工业或农业的化合物或基因、蛋白。

主权项

一种越野他汀的生物合成基因簇，其特征在于，所述基因簇包括编码越野他汀生物合成所涉及的55个基因，具体为：1)II型聚酮合成酶PKS相关基因：kstA1，kstA2，kstA3，kstD1，kstD2，kstD3，kstD4，kstD5，kstD6，kstD7，kstD8，kstD9，kstD10，kstD11，kstD12，kstD13，kstD14；共17个基因：kstA1位于基因簇核苷酸序列第9943‑11505位，编码腺苷酰化酶，长度为422个氨基酸；kstA2位于基因簇核苷酸序列第11507‑11770位，编码肽酰载体蛋白(PCP)，长度为402个氨基酸；kstA3位于基因簇核苷酸序列第26548‑26805位，编码酰基载体蛋白，长度为85个氨基酸；kstD1位于基因簇核苷酸序列第9140‑9946位，编码2,3‑环环化酶，长度为268个氨基酸；kstD2位于基因簇核苷酸序列第20823‑216026位，编码酮基还原酶，长度为259个氨基酸；kstD3位于基因簇核苷酸序列第22658‑21699位，编码芳香化酶，长度为319个氨基酸；kstD4位于基因簇核苷酸序列第23481‑22696位，编码C‑9位酮基还原酶，长度为261个氨基酸；kstD5位于基因簇核苷酸序列第23591‑24049位，编码单氧化酶，长度为152个氨基酸；kstD6位于基因簇核苷酸序列第26861‑27295位，编码第四环环化酶，长度为144个氨基酸；kstD7位于基因簇核苷酸序列第27391‑28233位，编码NAD(P)H:黄素氧化还原酶，长度为280个氨基酸；kstD8位于基因簇核苷酸序列第28260‑29156位，编码单氧化酶，长度为298个氨基酸；kstD9位于基因簇核苷酸序列第32267‑33358位，编码羧酸酯酶，长度为363个氨基酸；kstD10位于基因簇核苷酸序列第32267‑33358位，编码第四环环化酶，长度为150个氨基酸；kstD11位于基因簇核苷酸序列第52203‑51685位，编码脱氢酶，长度为172个氨基酸；kstD12位于基因簇核苷酸序列第54953‑54498位，编码羟化酶，长度为151个氨基酸；kstD13位于基因簇核苷酸序列第60078‑58579位，编码FAD依赖的或者包含BBE结构域的氧化还原酶，长度为499个氨基酸；kstD14位于基因簇核苷酸序列第60258‑61118位，编码甲基转移酶，长度为286个氨基酸；2)非核糖体聚肽合成酶NRPS相关基因：kstB1，kstB2，kstE1，kstE2，kstE3，kstE4，kstE5，kstE6；共8个基因：kstB1位于基因簇核苷酸序列第9943‑11505位，编码NRPS腺苷化酶，长度为520个氨基酸；kstB2位于基因簇核苷酸序列第11507‑11770位，编码酰基载体蛋白，长度为87个氨基酸；kstE1位于基因簇核苷酸序列第13618‑13992位，编码L‑ectoine合成酶，长度为124个氨基酸；kstE2位于基因簇核苷酸序列第14017‑15156位，编码酰基辅酶A脱氢酶，长度为379个氨基酸；kstE3位于基因簇核苷酸序列第55079‑55924位，编码羟化酶，长度为281个氨基酸；kstE4位于基因簇核苷酸序列第58555‑57470位，编码双氧化酶，长度为361个氨基酸；kstE5位于基因簇核苷酸序列第61163‑61852位，编码氨基转移酶，长度为229个氨基酸；kstE6位于基因簇核苷酸序列第63435‑64280位，编码脱甲酰酶，长度为281个氨基酸；3)乙酰化的糖基合成相关基因：kstC1，kstC2，kstC3，kstC4，kstC5，kstC6，kstC7，kstC8，kstC9；共9个基因：kstC1位于基因簇核苷酸序列第19574‑18678位，编码dTDP‑葡萄糖合成酶，长度为298个氨基酸；kstC2位于基因簇核苷酸序列第19786‑20775位，编码dTDP‑葡萄糖‑4,6‑脱水酶，长度为329个氨基酸；kstC3位于基因簇核苷酸序列第37944‑37360位，编码3,5‑表异构酶，长度为194个氨基酸；kstC4位于基因簇核苷酸序列第38165‑39175位，编码糖基转移酶辅助蛋白，长度为336个氨基酸；kstC5位于基因簇核苷酸序列第39198‑40496位，编码糖基转移酶，长度为432个氨基酸；kstC6位于基因簇核苷酸序列第40496‑41992位，编码2,3‑己糖脱水酶，长度为498个氨基酸；kstC7位于基因簇核苷酸序列第41989‑43014位，编码丙酮酸脱氢酶α亚基，长度为341个氨基酸；kstC8位于基因簇核苷酸序列第43031‑44068位，编码丙酮酸脱氢酶β亚基，长度为345个氨基酸；kstC9位于基因簇核苷酸序列第53344‑52361位，编码己糖‑3‑酮基还原酶，长度为327个氨基酸；4)负责吡咯吡咯二并环形成的后修饰基因：kstF1，kstF2，kstF3，kstF4，kstF5，kstF6；共6个基因：kstF1位于基因簇核苷酸序列第11773‑12807位，编码邻氨基苯甲酸磷酸核糖转移酶，长度为344个氨基酸；kstF2位于基因簇核苷酸序列第12800‑13621位，编码色氨酸合成酶α亚基，长度为273个氨基酸；kstF3位于基因簇核苷酸序列第15160‑15855位，编码邻氨基苯甲酸磷酸核糖异构酶，长度为231个氨基酸；kstF4位于基因簇核苷酸序列第15920‑16618位，编码吲哚甘油‑3‑磷酶合成酶，长度为232个氨基酸；kstF5位于基因簇核苷酸序列第54495‑53452位，编码Enoyl还原酶，长度为347个氨基酸；kstF6位于基因簇核苷酸序列第61849‑63372位，编码羧化酶，长度为507个氨基酸；5)抗性基因：kstRs1，kstRs2，kstRs3，kstRs4，kstRs5，kstRs6，kstRs7；共7个基因kstRs1位于基因簇核苷酸序列第30224‑31300位，编码ABC转运蛋白，长度为358个氨基酸；kstRs2位于基因簇核苷酸序列第31297‑32130位，编码ABC转运蛋白，长度为277个氨基酸；kstRs3位于基因簇核苷酸序列第35584‑34109位，编码外排蛋白，长度为491个氨基酸；kstRs4位于基因簇核苷酸序列第36608‑35625位，编码转运蛋白，长度为327个氨基酸；kstRs5位于基因簇核苷酸序列第44236‑47025位，编码SNF2/RAD54家族解螺旋酶，长度为929个氨基酸；kstRs6位于基因簇核苷酸序列第47037‑48338位，编码抗性蛋白，长度为433个氨基酸；kstRs7位于基因簇核苷酸序列第57431‑56853位，编码抗性蛋白，长度为192个氨基酸；6)调节基因：kstRg1，kstRg2，kstRg3，kstRg4，kstRg5，共5个基因：kgtRg1位于基因簇核苷酸序列第17553‑16669位，编码转录激活因子，长度为294个氨基酸；kgtRg2位于基因簇核苷酸序列第29233‑30021位，编码转录调节因子，长度为262个氨基酸；kgtRg3位于基因簇核苷酸序列第50317‑49112位，编码调节因子，长度为401个氨基酸；kgtRg4位于基因簇核苷酸序列第51422‑51649位，编码调节因子，长度为75个氨基酸；kgtRg5位于基因簇核苷酸序列第56007‑56840位，编码调节因子，长度为277个氨基酸；7)其他基因：kstU1，kstU2，kstU3；共3个：kgtU1位于基因簇核苷酸序列第48388‑48822位，编码未知功能蛋白，长度为144个氨基酸；kgtU2位于基因簇核苷酸序列第50774‑50304位，编码未知功能蛋白，长度为156个氨基酸；kgtU3位于基因簇核苷酸序列第51216‑50785位，编码未知功能蛋白，长度为143个氨基酸。