矮牵牛离体茎尖的超低温保存方法

摘要

本发明提供了一种矮牵牛离体茎尖的超低温保存方法，其主要基于小滴玻璃化法超低温保存技术，包括材料扩繁、茎尖剥取、预培养、装载、PVS2处理、超低温冷冻保存的步骤。通过对采用本发明的小滴玻璃化法超低温保存技术获得的矮牵牛离体茎尖进行植株再生培养，表明该法是一种长期安全、稳定可靠、简单有效的保存矮牵牛种质资源的方法，再生苗恢复生长良好，植株再生率可达50%以上。

主权项

一种矮牵牛离体茎尖的超低温保存方法，其包括材料扩繁、茎尖剥取、预培养、装载、PVS2处理、超低温冷冻保存的步骤；其特征在于：材料扩繁具体步骤如下：1）将矮牵牛试管苗接种在含0.5mg/L BA和30g/L蔗糖的MS固体培养基上进行扩繁；2）将扩繁的试管苗转移到不含激素的MS培养基中生根复壮，20d后，将生根苗转到含30g/L蔗糖的MS培养基中培养；培养温度为25±2℃，光照14h/d，光照强度为700 lux；茎尖剥取具体为：在无菌条件下，从继代15‑20d的矮牵牛无菌苗上剥取带2‑3片叶原基，直径大小2~3mm的离体茎尖为材料；预培养具体为：将剥取的茎尖在含0.2~0.4mol/L蔗糖的MS液体培养基中，于25℃振荡预培养1~3d，摇床转速为60rpm/min；装载具体为：将预培养后的离体茎尖置于装载液中室温装载20~40min；所述装载液的组成为：MS +2mol/L甘油+0.4mol/L蔗糖；PVS2处理具体为：将装载后的茎尖置于PVS2中，0℃处理30~50min；所述PVS2的组成为：MS + 30%甘油+15%乙二醇+15%二甲基亚砜+0.4mol/L蔗糖；超低温冷冻保存具体为：将经PVS2脱水处理后的茎尖置于铝箔条上，向茎尖上滴加PVS2溶液，使茎尖完全包裹于PVS2溶液小滴中，然后将铝箔条直接浸入液氮中进行冷冻，冷冻后将铝箔条装入冻存管中，拧紧盖子，最后投入液氮中保存。