一种枣实蝇快速鉴定的方法

摘要

本发明公开一种枣实蝇快速鉴定的方法，通过首次应用分子生物学方法对吐鲁番枣实蝇幼虫mtDNA COI基因序列进行DNA检测分析，采用形态学观察与PCR技术相结合的方法对枣实蝇Carpomya vesuviana Costa幼虫和蛹进行快速鉴定；最终首次测出枣实蝇mtDNA COI基因序列，同时证实本发明提供的枣实蝇快速鉴定的方法具有普遍性，为检验检疫部门提供非常快捷实用的方法，具有广泛的实用性。

主权项

一种枣实蝇快速鉴定的方法，其特征在于，具体鉴定方法步骤如下：(1)枣实蝇形态鉴定：对枣实蝇幼虫和蛹进行形态学观察，解剖镜下观察幼虫的头部特征、气门形状、尾部特征，蛹的气门特征等，并进行拍照，同时对多余的幼虫和蛹进行室内培养；枣实蝇标本的鉴定根据枣实蝇的形态学特征，用体式显微镜观察各鉴定部位包括头部、复眼、喙、中胸背板、翅脉、臀条、腹部、雌雄虫生殖器、根据外部形态进行鉴定，从而确定所用的材料均为枣实蝇；(2)选用枣实蝇的标本，采用试剂盒推荐的方法来提取基因组DNA和测序：取四头枣实蝇的蛹放入冰浴预冷的收集管(collection Tube)中，用研磨棒快速研磨成糊状，加入350μl的SolutionA和0.9μl的RnaseAI后用研磨棒加速研磨成匀浆，再加入350μl的Solution A将研磨棒上的匀浆冲入collection Tube中，充分振荡混匀后65℃保温5min后，加入4μl的试剂B，经充分混匀后，加入1ml事先在4℃冰箱里预冷的溶液SolutionC，充分混合后12000rpm离心3min，除去上面一层清液，再加入1ml事先在4℃冰箱里预冷的溶液SolutionC，震荡混合后12000rpm离心2min；除去上面一层带有蓝色有机相清液，然后将无色下层的水相溶液转置于collection Tube上面的Filter cup中，12000rpm离心1min，除去Filter cup，在滤液中加入DB buffer400μl并充分混匀，将试剂盒中的Spin column安放于collection Tube上，12000rpm离心1min，除去过滤后剩余的液体；将500μl的RinseA加入至Spin column中12000rpm离心30sec，除去过滤后剩余的液体；在Spin column中加入700μl的RinseB进行离心12000rpm30sec，除去过滤后剩余的液体；试剂盒中的Spin column安置于collection Tube上，12000rpm离心1min，除去过滤后剩余的液体；将Spin column安置于1.5ml的离心管 上，静置几分钟，等酒精挥发完后，将60‑100μl的灭菌蒸馏水或Elution Buffer在Spin column膜的中央处加入，在室温条件下放置1min，经12000rpm离心1min，洗脱DNA；(3)PCR扩增：目标片段PCR扩增的引物分别为Uea7和Uea10；PCR反应体系：PCR扩增在定量梯度PCR仪上进行，反应体系：10mmol/L10×Buffer，0.25mmol/LMg2+，0.25mmol/LdNTP，上下游引物各0.2μmol/L，1UTaq酶(Takara)，模板DNA1μL，加水至总体积25μL，反应条件为94℃/5min，95℃/40s，55℃/30s，72℃/1min，30个循环，最后72℃延伸7min。PCR反映结束后，分别提取PCR产物5μL在含溴化已锭的1.5％琼脂凝胶多功能电泳仪上电泳30min(90V)，数字图像分析仪上检测结果，观察扩增带的大小和宽度；(4)采用试剂盒的方法快速提取实蝇基因组DNA，经PCR扩增并测序，利用引物Uea7/Uea10分别测定了吐鲁番地区的鄯善县，托克逊县及吐鲁番市枣实蝇的线粒体DNA细胞色素氧化酶I(COI)从M7至COOH之间约700bp片段序列，共获得COI基因序列4条片段长度为666bp的序列；将PCR产物基因序列进行比较，即将枣实蝇mtDNACOI基因序列比较分析，将测得的基因序列选用Clustal X多序列对位排列程序进行多序列对位排列可知序列完全相同，并且进行人工校对，将枣实蝇mtDNACOI基因序列录入GenBank数据库，序列号为HQ687210；经测序比较发现，扩增产物目的基因序列完全相同，将试验所得序列与测出的枣实蝇模式标本基因序列比较分析确定为枣实蝇。