一种牙本质磷蛋白的检测方法及其装置

摘要

本发明公开了属于电化学酶联免疫测试技术领域的一种牙本质磷蛋白的检测方法及其装置。在由电解池、检测仪表和储汞瓶串联连接，及外加电源与检测仪表连接构成的装置中采用“双抗体夹心法”酶联免疫反应及“电化学”检测法相结合精确测定牙本质磷蛋白的精确含量，采用“滤纸吸着法”提取患者口腔龈沟液中的牙本质磷蛋白，并采用“蛋白提取液纯化法”提纯提取患者口腔龈沟液中的牙本质磷蛋白，提纯后放入离心密封管作待测样品；本发明可以实现对龈沟液中牙本质磷蛋白变化规律的精确检测，可以实现对患者牙根吸收的早期诊断；本检测方法具有操作简单、灵敏度高、无辐射损伤等优点，在牙根吸收的临床诊断中具有良好的应用前景。

主权项

1.一种牙本质磷蛋白的检测方法，其特征在于所述牙本质磷蛋白的检测方法是基于电化学酶联免疫的测定法；包括牙本质磷蛋白的提取及纯化和电化学“双抗体夹心”酶联免疫方法检测牙本质磷蛋白的含量两个步骤；1）牙本质磷蛋白的提取和纯化：采用“滤纸吸着法”提取患者口腔龈沟液中的牙本质磷蛋白，并采用“蛋白提取液纯化法”提纯：取样前，首先清洁口腔牙面并吹干将吸潮试纸尖端紧贴于牙齿的颊舌侧牙面的龈沟边缘，放置30秒以上，取出后放入离心密封管作待测样品，并于-70℃保存；待测样品提纯是在待测样品中加入20μl蛋白提取液，冰浴20～30分钟，于4℃下15000转/分钟离心10分钟后，提取20μl上清液，加入等量蛋白上样液，煮沸并冷却，于-20℃保存待测；其中蛋白提取液配制是：先以300～500ml蒸馏水溶解60.57g三羟甲基氨基甲烷，加入HCl后，用浓度为1mol/L的HCl或浓度为1mol/L的NaOH，将pH调至7～8，最后蒸馏水加至1000ml，得到浓度为0.5mol/L的蛋白提取液，在4℃冰箱中保存备用；蛋白上样液配制是：先量取120ml上述0.5mol/L蛋白提取液，依次加入200ml质量浓度比为10%的十二烷基磺酸钠SDS水溶液，500ml质量浓度比为50%的甘油水溶液，50ml的2-巯基乙醇,100ml质量浓度比为1%的溴酚兰水溶液，最后蒸馏水加至1000ml，在4℃冰箱中保存备用；2）电化学酶联免疫方法检测牙本质磷蛋白含量：a.基于“双抗体夹心法”酶联免疫反应及“电化学”检测法相结合精确测定牙本质磷蛋白的精确含量；酶联免疫反应过程为将兔抗牙本质磷蛋白抗体吸附到以聚苯乙烯容器作为固相载体上，孵育后洗涤除去未吸附的抗体；加入含有待测牙本质磷蛋白的抗原样品，使之与吸附于固相载体上的兔抗牙本质磷蛋白抗体反应，孵育后洗涤除去未反应的样品；加入辣根过氧化物酶标记的特异性牙本质磷蛋白抗体与待测牙本质磷蛋白的抗原反应，形成所谓“双抗体夹心抗原”结构，此时酶与双抗体夹心抗原之间形成等量关系；最后加入主要成分包括邻氨基酚和过氧化氢的底物，在酶催化下，底物邻氨基酚和过氧化氢反应生成可进行电化学方法精确测定的产物氨基吩噁嗪；b.“电化学”测试法为邻氨基酚和过氧化氢的底物溶液在辣根过氧化物酶催化下，过氧化氢将邻氨基酚氧化生成产物氨基吩噁嗪，氨基吩噁嗪在汞电极上发生还原反应，其反应电流的大小与氨基吩噁嗪的量呈正比定量关系，进而与辣根过氧化物酶的量呈I=22.6-5.5log₂X,式中I为反应电流的大小，单位为微安A，X为辣根过氧化物酶的含量，单位为纳克每毫升ng/ml，则通过测定上述反应电流的大小，测定氨基吩噁嗪的量，进而测定辣根过氧化物酶的量，进而测定待测样品中牙本质磷蛋白的量。