一种低血凝活性且高α-葡萄糖苷酶活性的芸豆凝集素的制备方法

摘要

本发明涉及一种低血凝活性且高α-葡萄糖苷酶活性的芸豆凝集素的制备方法。具体包括下列步骤：芸豆粗提物的制备；硫酸铵沉淀；亲和层析；离子交换层析；以10-50MPa的压力均质；以5-50kV/cm的电场强度的脉冲电场处理；将处理后的芸豆凝集素取出，经冷冻干燥得到芸豆凝集素粉末。本发明发现经过这种方法处理以后，对比80-120℃热处理20-40min，芸豆凝集素的血凝活性降低同时α-葡萄糖苷酶抑制活性大部分保留，即一方面有效的降低了芸豆的抗营养性，另一方面提高了其有益的α-葡萄糖苷酶抑制活性。

主权项

一种低血凝活性且高α‑葡萄糖苷酶活性的芸豆凝集素的制备方法，其特征在于包括下列步骤：（1）芸豆提取物的制备：将芸豆预先浸泡后与tris缓冲液混合匀浆，0‑4℃静置过夜提取，四层纱布过滤后离心，取上清液，得芸豆提取物；（2）硫酸铵沉淀：向上清液中加入固体(NH4)2SO4至饱和度10%‑90%，0‑4℃静置过夜，离心取沉淀；将沉淀溶于蒸馏水，0‑4℃透析8‑12 h，除盐，冷冻干燥得芸豆凝集素粗品；（3）亲和层析：采用Affi‑gel blue柱，流动相A是10‑100 mmol/L tris‑HCl，pH 6.8‑7.4，流速为0.5‑2mL/min，并用流动相A溶解凝集素粗提物；流动相B是在流动相A中加入NaCl至浓度为1‑3 mol/L，并用其进行洗脱；用280 nm的紫外光检测，收集各个蛋白峰，放入透析袋0‑4℃对水透析12‑36 h，冷冻干燥，分别检测其血凝活性，保留活性最高的组分进行下一步分离纯化；（4）离子交换柱层析：采用Cm‑Sepharose柱，本步骤采用的流动相A是10‑100 mmol/L 乙酸‑乙酸铵，pH 4.5‑5.5，流速为0.5‑2mL/min，并用流动相A溶解上一步分离纯化得到的组分；流动相B是在本步骤流动相A中加入NaCl至浓度为0.05‑1.2 mol/L，并用其进行洗脱；用280 nm紫外光检测，收集各个蛋白峰，放入透析袋0‑4℃对水透析12‑36 h，冷冻干燥，分别检测其血凝活性，收集活性最高的组分即为芸豆凝集素；（5）均质处理：将分离纯化得到的芸豆凝集素样品用水稀释至0.5%‑5%蛋白质量浓度进行均质；（6）低温脉冲电场处理：将均质后的芸豆凝集素样品在脉冲电场中进行处理，用冰袋控制温度在25°C以下；收集处理后的芸豆凝集素溶液，经冷冻干燥得到芸豆凝集素粉末。