悬浮培养细胞制造兽用狂犬灭活冻干疫苗工艺

摘要

本发明涉及一种制造兽用狂犬灭活疫苗的新型工艺，具体为，悬浮培养细胞制造兽用狂犬灭活冻干疫苗工艺。该方法的核心是利用生物反应器大规模悬浮培养BHK21-C13细胞并接种狂犬种毒，通过流加、灌流技术使狂犬病毒大量繁殖，从而获得高浓度及高滴度的狂犬抗原，经浓缩灭活纯化后制备兽用狂犬灭活疫苗，克服了目前工艺繁琐、抗原含量低，效力低，剂量大、批间差大等技术难题。

主权项

悬浮培养细胞制造兽用狂犬灭活冻干疫苗工艺，该方法利用悬浮培养的高密度细胞，接种狂犬病毒，将收获的狂犬病毒液灭活纯化后制备兽用悬浮狂犬灭活疫苗。其特征在于，所述高密度悬浮细胞通过以下培养方法而制得：反应器按照0.2～0.5×106细胞/ml接种BHK21‑C13细胞，设定细胞培养温度：36.5±0.5℃，pH：7.20±0.1，DO：20％～60％，转速：60～110rpm；利用BHK21‑C13细胞悬浮工艺培养狂犬病毒的方法为：使所述反应器内的BHK21‑C13细胞培养密度大于2×106细胞/ml，更换培养液以终培养体积的0.5～1.0％接入狂犬病毒生产种毒进行培养，设定狂犬病毒培养温度：34.0±1℃，pH：7.40‑7.60，DO：20％～60％，转速：60～110rpm，累计培养96～120h，收获病毒液，‑20℃保存备用，每0.03ml中病毒含量≥105.5，反应器接种的0.2～0.5×106细胞/ml的BHK21‑C13悬浮细胞通过以下方法获得：从液氮中取出一支冻存的BHK21‑C13悬浮细胞株，贴壁培养1‑3代，将贴壁培养BHK21‑C13细胞消化，更换悬浮培养基，使接种密度在0.2～0.5×106细胞/ml，悬浮培养1‑3代，扩增至反应器所需体积和密度，所述狂犬种毒为Flury‑LEP毒株，所述狂犬病毒生产种毒利用BHK21‑C13细胞悬浮培养狂犬贴壁生产种毒并连续传1～3代而得，所述狂犬病毒生产种毒的制备方法为：取长势良好的悬浮BHK21‑C13细胞，更换培养液以终培养体积的0.5‑1％接入狂犬贴壁生产种毒，设定病毒培养的pH值为7.40‑7.60，DO：20％～60％，转速：60～110rpm，温度：34.0±1℃；累计悬浮培养96‑120h，待细胞密度＜1×106细胞/ml时收获病毒液，取样检测LD50，连续传1‑3代做为生产种毒，‑20℃保存备用，每0.03ml中病毒含量≥105.5。