具有经修饰的特异性的I-CreI大范围核酸酶变体、其制备方法及应用

摘要

制备具有经修饰的切割特异性的1-CreI大范围核酸酶变体的方法，通过所述方法可获得的变体及其或者用于切割新DNA靶标或者用于非治疗目的的遗传工程和基因组工程的应用。编码所述变体的核酸、包含所述核酸的表达盒、包含所述表达盒的载体、被所述载体转化的细胞或生物，植物或非人动物。

主权项

制备具有经修饰的切割特异性的I‑CreI大范围核酸酶变体的方法，所述方法包括：(a)参照I‑CreI pdb登记码1g9y，将氨基酸Q44、R68和/或R70替换为选自A、D、E、G、H、K、N、P、Q、R、S、T和Y的氨基酸；(b)选择步骤(a)中获得的针对双链DNA靶标中‑5至‑3位而言具有至少一个下列R3三联体切割模式的I‑CreI大范围核酸酶变体，所述‑5至‑3位对应于下式I的R3：5’‑R1CAAAR2R3R4R’4R’3R’2TTTGR’1‑3’，其中：R1不存在或存在；并且当存在时代表包含1至9个核苷酸的核酸片段，所述核酸片段对应于随机核酸序列或对应于位于从‑20至‑12位(从5’向3’)的I‑CreI大范围核酸酶归巢位点的片段，R1至少对应于所述归巢位点的‑12位，R2代表核酸双联体ac或ct并且对应于所述归巢位点的‑7至‑6位，R3代表对应于所述‑5至‑3位的核酸三联体，选自g、t、c和a，并排除以下的三联体：gtc、gcc、gtg、gtt和gct，R4代表核酸双联体gt或tc并且对应于所述归巢位点的‑2至‑1位，R’1不存在或存在；并且当存在时代表包含1至9个核苷酸的核酸片段，所述核酸片段对应于随机核酸序列或对应于位于从+12至+20位(从5’向3’)的I‑CreI大范围核酸酶归巢位点的片段，R’1至少对应于所述归巢位点的+12位，R’2代表核酸双联体ag或gt并且对应于所述归巢位点的+6至+7位，R’3代表对应于所述+3至+5位的核酸三联体，选自g、t、c和a；当R3和R’3是非回文序列时，R’3不同于gac、ggc、cac、aac以及agc，R’4代表核酸双联体ga或ac并对应于所述归巢位点的+1至+2位。