一种基于PCR-LDR技术的检测拷贝数变异的方法

摘要

本发明涉及基于通用荧光引物的多重竞争性PCR检测拷贝数变异的方法，包括下列步骤：（1）提供多重竞争性PCR引物，由至少一对待测区段引物和至少一对参照区段引物组成；（2）提供竞争性内对照模板，内对照模板序列与实际序列在序列中仅有一个碱基替换；（3）多重竞争性PCR反应；（4）LDR反应；和（5）数据分析。本发明还提供基于以上检测方法的试剂盒，适用于5~25个基因/反应的拷贝数变异的检测，是一种快速、中通量、经济的拷贝数变异检测方案。

主权项

一种多重竞争性PCR和LDR联合检测拷贝数变异的方法，包括以下步骤：（1）提供多重竞争性PCR引物：所述的多重竞争性PCR引物由分别针对待测区段和参照区段设计的至少一对待测区段引物和至少一对参照区段引物组成，TM值≥62℃，长度范围为18~50bp，所述多重竞争性PCR引物所产生的不同扩增产物片段间的长度差异没有要求；（2）提供内对照序列：通过全基因合成法合成一条与所述多重竞争性PCR的扩增产物片段之一相比仅一个替换碱基的差异的序列，且所述替换碱基的位置不在引物结合区；或者通过载体克隆法将PCR产物克隆到质粒上，并在某个碱基上导入替换突变，且所述替换突变的碱基的位置不在引物结合区；（3）多重竞争性PCR反应：将含待测区段和参照区段的待测样本和对照样本分别与所述内对照的稀释液混合在一起，所述待测样本和所述对照样本的DNA分子数分别与所述内对照稀释液的DNA分子数相差10倍范围内，进行多重竞争性PCR反应；（4）多重LDR测序反应：取所述多重竞争性PCR反应的产物与含所述测序探针的LDR反应体系混合，进行LDR测序反应；（5）LDR测序产物电泳分离：对所述LDR测序反应的产物进行电泳分离，利用LDR测序反应将单碱基差异转变成序列长度差异的原理将所述待测样本或所述对照样本分别与内对照产物区分开、且利用LDR测序产物的浓度和模板浓度成线性关系的原理，通过检测LDR测序产物在电泳分离后的浓度分别获得所述待测样本、所述对照样本、和所述内对照所对应的各个模板的相对浓度，所述的相对浓度以电泳分离片段的峰高和/或峰面积表示；（6）数据分析i.将每个待测区段和参照区段的峰高和/或峰面积（S）和内对照的峰高和/或峰面积（I）作比，得到每个待测区段和参照区段的比值（S/I）；ii以一个参照区段的比值为标准，将其他待测区段和参照区段的比值分别同其作比，进行数据内部标化；iii.将待测样本和对照样本的内部标化值作比，获得待测样本与对照样本的比值，该比值乘以对照样本的拷贝数，得到待测样本的拷贝数。