一种Her-2/neu重组腺相关病毒载体及其构建方法与应用

摘要

一种Her-2/neu重组腺相关病毒载体(rAAV)及其构建方法与其应用。该rAAV是将腺相关病毒载体中的腺相关病毒结构基因替换为肿瘤抗原基因Her-2/neu或其突变型基因得到。本发明的rAAV可将其携带的野生型或突变型的Her-2/neu基因输送入单核细胞-树突状细胞系中，被用于刺激免疫系统的效应细胞。实验证明，被本发明的rAAV感染的DC所诱导的CTL在患者体内可有效地抑制恶性肿瘤细胞的生长或者杀灭肿瘤细胞。本发明的重组腺相关病毒载体或其相关产品可被用于制备治疗乳腺癌、结肠癌、肺腺癌、卵巢癌等的药物。

主权项

一种Her‑2/neu重组腺相关病毒载体，是将腺相关病毒载体中的腺相关病毒结构基因替换为Her‑2/neu抗原基因或其突变型基因，将p5启动子替换为CMV启动子、beta肌动蛋白启动子和SV40病毒启动子得到的；所述Her‑2/neu突变型基因为：由引物9：GTCTTGATCCAGCGGAAC和引物10：GGACGTCAGAGGGCTGGC引导扩增得到的Her‑2/neu cDNA片段A，由引物11：CTGGAAGAGATCAC和引物12：CCACACATCACTCTG引导扩增得到的Her‑2/neu cDNA片段B，或由引物13：CTGGTGACACAGCTTATG和引物8：TCACACTGGCACGTCCAGACC引导扩增得到的Her‑2/neu cDNA片段C；其构建方法包括以下步骤：A.pBR‑AAV2质粒的改建：先用限制性内切酶Bst98I和Hpa I将pBR‑AAV2质粒中的腺相关病毒AAV基因组的结构基因Rep和Lip/Cap基因完全切除，然后将含有限制性内切酶EcoR I和EcoR V酶切位点的核苷酸序列CGAATTCATGCGATATCGTT插入质粒中，保留两端完整的TR序列或将AAV基因组的两端TR的第75位核苷酸序列处均插入由9个核苷酸组成的片段CTGCGCTGG；B.采用基因扩增技术扩增CMV启动子和SV40早期启动子；C.PCR扩增beta肌动蛋白启动子、全长Her‑2/neu cDNA和所述Her‑2/neucDNA片段；D.采用DNA连接技术，将上述扩增的CMV启动子、SV40早期启动子、beta肌动蛋白启动子、全长Her‑2/neu cDNA或所述Her‑2/neu cDNA片段依次插入步骤A经改建的pBR‑AAV2载体中，为插入启动子，首先进行酶切反应，然后进行连接反应，得到携带有CMV启动子、SV40早期启动子、beta肌动蛋白启动子和全长Her‑2/neu cDNA的Her‑2/neu重组腺相关病毒载体，命名为rAAV/Her‑2/neu，或携带有CMV启动子、SV40早期启动子、beta肌动蛋白启动子和Her‑2/neu cDNA片段的突变型Her‑2/neu重组腺相关病毒载体，命名为rAAV/mHer‑2/neu。