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一种快速鉴定绿潮藻类浒苔的方法，其特征在于：该方法利用核酸杂交技术，使用两条DNA双链探针，定性地判定测定样品是否为绿潮藻类浒苔；所述鉴定方法步骤如下：1)以CTAB法提取待测样本和已确定为浒苔的标准样本的总DNA；2)采用PCR扩增方法，以引物ITS4和ITS5扩增待测样本的核糖体RNA转录间隔区ITS序列，以引物5S_space_F和5S_space_R扩增标准样本的5s核糖体RNA串联重复序列间隔区5SS序列；3)将标准样本的ITS序列和5SS序列通过分子克隆方法连接为一条序列，记为Up_ITS&Up_5SS，连接到质粒载体上并转化保存于大肠杆菌中；4)使用紫外分光光度计对PCR扩增得到的含有待测样本ITS和5SS序列和含有标准样本Up_ITS和Up_5SS序列的DNA溶液进行浓度定量，将含有待测样本ITS和5SS序列的DNA溶液分别稀释至0.5ng/μl，将含有Up_ITS和Up_5SS序列的DNA溶液分别稀释至1ng/μl、0.5ng/μl、0.25ng/μl；5)使用PCR方法，以所提取的标准样本总DNA为模板，分别扩增并纯化作为探针使用的两条DNA序列，即以引物U.p_tz_f1和U.p_tz_r1扩增记为ITS_TZ的核苷酸序列，以Up5S_tz_F1和Up5S_tz_R1扩增记为5SS_TZ的核苷酸序列；6)使用地高辛标记的方法标记作为探针的两条序列，并在使用前煮沸变性，加入到不含有探针的预杂交液中；7)取2μl稀释好的含有待测样本ITS和5SS序列的DNA溶液和分别稀释至1ng/μl、0.5ng/μl、0.25ng/μl的含有标准样本Up_ITS和Up_5SS序列的DNA溶液煮沸变性后，点在带有正电荷的尼龙膜上，将含有5SS序列和 ITS序列的DNA溶液各自点在单独的膜上，烘烤固定后，与不含有探针的杂交液预杂交后，再与含有探针的杂交液进行杂交，点有5SS序列的膜与含有5SS_TZ的杂交液进行杂交，点有ITS序列的膜与含有ITS_TZ的杂交液进行杂交，过夜，洗去未杂交的探针，显色步骤按照所使用探针标记检测试剂盒说明书的操作，每隔5min观察一次显色情况，当点有U.prolifera 0.5ng PCR产物的点出现浅蓝色斑点后，立即终止反应；8)对显色结果进行分析，使用扫描仪对膜进行灰度扫描，通过直接目测的方法判断显色深度，如比较接近，用TANON点杂交分析系统进行分析；如果样本1ng的显色深度明显低于标准样本0.5ng的点，则判定为阴性杂交信号；反之，如果样本1ng的显色深度介于标准样本0.5ng和1ng的点之间，或基本与标准样本1ng的点持平，则为阳性杂交信号；9)如果样本的ITS序列无阳性杂交信号，则无论5SS序列是否有阳性杂交信号，立刻判定该样本不是绿潮藻类浒苔；如果样本的ITS序列有阳性杂交信号，而5SS序列无阳性杂交信号，则判定为该样本为石莼属藻类，而不是绿潮藻类浒苔；如果样本的ITS序列有阳性杂交信号，5SS序列亦有阳性杂交信号，则判定该样本为绿潮藻类浒苔；步骤3)中所述的质粒载体为pMD18‑T/Up_ITS&Up_5SS，是携带有总长为1452bp的核苷酸插入序列，包含Up_ITS序列和Up_5SS序列，所涉及的序列信息如下：1‑973位点为Up_ITS序列；999‑1452位点为Up_5SS序列；389‑553位点为ITS_TZ序列；1172‑1294位点为5SS_TZ序列；该质粒载体pMD18‑T/Up_ITS&Up_5SS存在于大肠杆菌(Escherichia coli)DH5αZC‑6菌株中，其菌种保藏号CCTCC M 209301，菌种分类命名：大肠杆菌(Escherichia coli)DH5αZC‑6，菌种保藏日为2009年12月14日；步骤3)中所述标准样本的Up_ITS序列，为序列表第1号序列所示的核苷酸序列，长为973bp，作为鉴定样本ITS序列的阳性对照的标准样本，扩增该序列的引物为ITS4和ITS5，ITS4、ITS5分别为序列表第5、6号序列所示的核苷酸序列；Up_ITS序列保存于质粒载体pMD18‑T/Up_ITS&Up_5SS中；步骤3)中所述标准样本的Up_5SS序列，为序列表第3号序列所示的核苷酸序列，长为454bp，作为鉴定样本5SS序列的阳性对照的标准样本，扩增该序列的引物为5S_space_F和5S_space_R，5S_space_F、5S_space_R分别为序列表第7、8号序列所示的核苷酸序列；Up_5SS序列保存于质粒载体pMD18‑T/Up_ITS&Up_5SS中；步骤5)中所述的两条鉴定浒苔的DNA双链探针，其中ITS_TZ序列来自于扩增的Up_ITS序列中的10‑174位点的核苷酸序列，为序列表第2号序列所示的核苷酸序列，长为165bp，扩增该序列的引物序列为U.p_tz_f1和U.p_tz_r1，U.p_tz_f1、U.p_tz_r1分别为序列表第9、10号序列所示的核苷酸序列；ITS_TZ序列保存于质粒载体pMD18‑T/Up_ITS&Up_5SS中；步骤5)中所述的两条鉴定浒苔的DNA双链探针，其中5SS_TZ序列来自于扩增的Up_5SS序列中的132‑254位点的核苷酸序列，为序列表第4号序列所示的核苷酸序列，长为123bp，扩增该序列的引物序列为Up5S_tz_F1和Up5S_tz_R1，Up5S_tz_F1、Up5S_tz_R1分别为序列表第11、12号序列所示的核苷酸序列；5SS_TZ序列保存于质粒载体pMD18‑T/Up_ITS&Up_5SS中。 |
