一种快速高效的均一化全长cDNA文库构建方法

摘要

一种高效快速的均一化全长cDNA文库构建方法，该方法利用特定的5-OH寡核苷酸封闭非全长mRNA，在用烟草酸焦磷酸酶除去mRNA5′端的帽子结构，使mRNA5′端帽子结构处的磷酸基团暴露出来，用高效的RNA连接系统在mRNA的5′端连上一段优化的寡聚核糖核酸作为引发第二链cDNA合成的引物结合位点，最后经反转录，二链合成、分级纯化后，将双链DNA克隆于载体中。该方法具有简洁高效的全长mRNA筛选功能，实现对真核生物全长mRNA的捕获，mRNA5′末端含有生物素标记，可用于全长mRNA分离，所用寡核苷酸引物含有优化的修饰方法及核苷酸序列，可实现真核生物mRNA全场捕获、反转录以及DNA的合成。

主权项

一种高效快速的均一化全长cDNA文库构建方法，包括mRNA的差减/均一化处理，全长cDNA的获得，二链cDNA的合成及文库的获得，其特征在于差减/均一化处理采用直接在磁珠上合成cDNA第一链后与mRNA进行杂交后，用磁珠分离法将高表达的mRNA除去得到稀有表达的mRNA；全长cDNA的获得以及二链cDNA的合成结合改进后的Oligo‑capping法一步获得全长mRNA以及改进后的Cap‑trapper法获得第二链cDNA。