筛选醛糖还原酶抑制剂的方法

摘要

筛选醛糖还原酶抑制剂的方法，解决了现有技术中光谱法易受背景干扰，引起假阳性和假阴性结果的问题。本发明以葡萄糖为底物，醛糖还原酶在25-37摄氏度催化葡萄糖生成山梨醇，用超高效液相色谱和质谱联用对山梨醇进行定量，进一步计算出天然产物提取物、单体及合成类的醛糖还原酶抑制剂对醛糖还原酶的抑制率。本发明的筛选方法快速、准确，线性方程相关系数达到0.999，可用于醛糖还原酶抑制剂的筛选及醛糖还原酶的动力学研究。

主权项

筛选醛糖还原酶抑制剂的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)酶促反应缓冲液的配制缓冲液是pH值为6.0‑6.4的醋酸铵水溶液；(2)标准品的配制将山梨醇分别配成浓度为0.1微摩尔/升、0.2微摩尔/升、0.5微摩尔/升、1微摩尔/升、2微摩尔/升、5微摩尔/升、10微摩尔/升、20微摩尔/升、50微摩尔/升的标准品溶液，且每个浓度的标准品溶液均含1微摩尔/升的木糖醇作为内标；(3)空白样品和样品的酶促反应空白样品：反应总体积200微升，含有体积为30微升的醛糖还原酶、终浓度5毫摩尔/升的2‑巯基乙醇、终浓度150微摩尔/升的NADPH、终浓度10毫摩尔/升的底物葡萄糖，其余以缓冲液补足；样品：反应总体积200微升，含有体积为30微升的醛糖还原酶、终浓度5毫摩尔/升的2‑巯基乙醇、终浓度150微摩尔/升的NADPH、终浓度0.1‑50微摩尔/升的待测物、终浓度10毫摩尔/升的底物葡萄糖，其余以缓冲液补足；空白样品和样品在25‑40摄氏度反应15‑40分钟，分别加入甲醇或乙腈终止反应，分别加入终浓度为1微摩尔/升的内标木糖醇；(4)标准品、空白样品和样品的检测对(2)中的标准品进行超高效液相色谱和质谱检测，从总离子流图中提取山梨醇和木糖醇的色谱图，分别积分求峰面积，以标准品浓度为横坐标，以山梨醇与木糖醇峰面积比值为纵坐标，或以标准品浓度为纵坐标，以山梨醇与木糖醇的峰面积比值为横坐标，得到山梨醇浓度的线性方程；对空白样品、样品溶液进行超高效液相色谱和质谱检测；所述的超高效液相色谱的检测条件：色谱柱： Waters ACQUITY UPLC BEH  C18  2.1×50毫米，1.7微米；流动相：甲醇和水； 等度洗脱程序：0‑2 分钟，20%甲醇，所指的百分比均为体积百分比；流速：0.2毫升/分钟；进样量：3微升；所述的质谱检测条件：毛细管电压：3000伏特；去溶剂气氮气温度：350摄氏度；锥孔电压：14伏特；去溶剂气氮气流速：800升/小时；锥孔气氮气流速：60升/小时；碰撞气氩气流速：0.15毫升/分钟；(5)待测物对醛糖还原酶的抑制率分别计算空白样品、样品中山梨醇峰面积和内标木糖醇峰面积的比值，根据(4)得到的线性方程，求得空白样品和样品中山梨醇的浓度，计算出待测物对醛糖还原酶的抑制率。