建兰花叶病毒双抗夹心酶联检测试剂盒及其制备和检测方法

摘要

本发明公开了建兰花叶病毒双抗夹心酶联检测试剂盒及其制备方法和检测方法，试剂盒由盒体，设在盒体内的各种用液和酶标板组装成经济实用的检测试剂盒。试剂盒的制备方法简便、快捷、安全、可靠且经济实用。样品用量少，在较短的时间内就可以完成检测，且结果易于保存，应用该检测试剂盒进行双抗夹心酶联检测的方法与其他血清学检验方法相比具有简单、快速、敏感、特异性强等特点，并具有较高的可重复性、经济实用等更多的优点，所以便于在基层单位推广应用。

主权项

建兰花叶病毒双抗夹心酶联检测试剂盒，主要由盒体，设在盒体内的各种用液和酶标板组成，各种用液主要包括高效价抗血清、标记抗体、阳性样品和阴性样品，各种缓冲液和显色剂，其特征在于：所述的高效价抗血清：选用雄性白兔作免疫动物，加等量Freund氏不完全佐剂乳化的提纯病毒做免疫原，采用三次肌肉注射和两次静脉注射免疫家兔，每次注射病毒的量分别是0.5mg、0.75mg、1mg、1.5mg和2mg，间隔时间为7天，最后一次注射后7‑10天采血2次，析出血清用琼脂双扩散法测定效价；通过辛酸沉淀法结合DEAE离子交换层析纯化抗体，用2倍体积0.1M醋酸铵调节抗血清至pH4.8，按0.75ml辛酸/1ml血清加入正辛酸，混合搅拌1小时，5000rpm离心30分钟，取上清，将透析袋置于10mM Tris‑Cl pH8.5缓冲液过夜，透析除盐，取透析完全的溶液上样于离子交换柱中，用10mM Tris‑HClpH8.5缓冲液5ml/min冲洗15分钟，再用含0‑1M NaCl的10mMTris‑HCl pH8.5缓冲液浓度梯度进行洗脱，收集洗脱峰部分，浓缩透析，获得纯化的建兰花叶病毒多克隆抗体；所述的标记抗体：通过戊二醛二步法将碱性磷酸酶标记到纯化抗体，每1mg抗体加0.1％戊二醛0.05ml，静置1小时，置于透析袋中除去多余戊二醛，加入0.5mg碱性磷酸酶，混匀后置于4℃备用；所述的阳性样品为纯化的建兰花叶病毒；浓度在0.1μg‑100μg/ml范围；所述的阴性样品为封闭缓冲溶液研磨健康叶制备的溶液；所述的缓冲液包括：包被缓冲液：20‑80mmol/L pH9.6碳酸盐溶液；封闭缓冲液：20‑100mmol/L pH7.4 PBS+1‑5％脱脂奶粉；洗涤缓冲液：50‑200mmol/L pH7.4 PBS+0.05‑0.3％ Tween20；底物缓冲液：5‑20％ pH9.8二乙醇胺溶液；终止液：1‑5mol/L硫酸溶液；所述的显色剂为0.05‑0.5mg/ml pH9.8 PNP‑Na溶液。