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一种以脐带为来源的间充质干细胞的制备方法，其特征在于，经过以下步骤：1).无菌条件下采集正常顺产或剖腹产者胎儿脐带，用含0.2％庆大霉素、0.54％枸橼酸钠抗凝剂的生理盐水保存脐带组织；2).将脐带置于含0.2％庆大霉素的生理盐水中，反复冲洗2‑3次，用无菌剪刀剪断脐静、动脉血管，剔除肉眼可见的血管组织和可能存在的血凝块，用剪刀将脐带剪切至2‑3cm大小，收集组织块置于50ml离心管内，高速离心，离心机转速为2000转/分钟，离心10分钟，弃掉上清，重新加入含0.2％庆大霉素的生理盐水，将沉淀的组织块充分振荡，使之松散，高速离心，离心机转速为2000转/分钟，离心10分钟；3).将步骤2所获的组织块用含15％胎牛血清、0.2％庆大霉素的α‑MEM培养基悬浮，充分振荡后高速离心，离心机转速为2000转/分钟，离心10分钟；4).将步骤3所获的脐带组织块平铺于塑料培养瓶内，各组织块间存留1‑2cm空隙，置于37℃5％CO2培养箱内60分钟，待组织块完全贴壁后，补加含15％胎牛血清、0.2％庆大霉素的α‑MEM培养基；5).每培养3‑5天进行半量换液处理；6).于培养第10‑12天左右在倒置显微镜下观察到组织块周围出现贴壁、梭型或多角型细胞时，将组织块全部吸出，补加含15％胎牛血清、0.2％庆大霉素的α‑MEM培养基，置于5％CO2培养箱中继续培养，成为形态较为均一的长梭型细胞，呈涡旋状生长；7).待涡旋状生长的细胞80％融合后，先用生理盐水反复冲洗培养瓶3次，再用含0.05％胰酶/0.2mM EDTA的消化液消化细胞，按1∶3比例传代，培养条件更换为含10％胎牛血清、0.2％庆大霉素的α‑MEM培养基；8).经20‑25天扩增后，细胞传至4～5代，获得大量间充质干细胞；9).将扩增后细胞先用预冷的培养基重悬，随后滴加预冷的含DMSO的胎牛血清，其中培养基、胎牛血清和DMSO的比例为5∶4∶1，将重悬后的细胞放入冻存盒内，‑70℃冰箱放置隔夜后置于液氮中保存即可。 |
