一种噬菌体抗体库及其在农药残留免疫测定中的应用

摘要

本发明涉及一种噬菌体抗体库，是在pCANTAB5E载体的SfiI和NotI酶切位点间组装ScFv基因片段，其特征在于：所述的ScFv基因片段可以与十六元大环内酯类农药的抗原亲和富集，形成可溶性单链抗体，并将其应用于农药残留免疫测定中。其优点是：可以不经动物免疫获得高亲和力抗体，试验周期短，此抗体库以十六元大环内酯共性结构小分子米尔比霉素肟化物为免疫原构建的噬菌体抗体库，理论上经过筛许可以直接获得十六元大环内酯类化合物的特异性抗体库，其筛选通量高、效率高、特异性强及亲和选择范围广，使其在农药抗体制备和检测技术发展等方面具有广泛的应用前景。

主权项

一种噬菌体抗体库，是在pCANTAB5E载体的SfiI和NotI酶切位点间组装ScFv基因片段，其特征在于：所述的ScFv基因片段是这样构建的：a)MILO‑BSA免疫Balb/c小鼠后，提取小鼠脾细胞总RNA，以其为模板，Oligo(dT)15为引物合成cDNA第一链；b)设计下列简并性引物：含部分Linker序列的VLB引物：5’‑tct ggc ggc ggc ggc tcc ggt ggt ggt gga tcc GAC ATT GTG MTM ACT CAGTC‑3’；5’‑tct ggc ggc ggc ggc tcc ggt ggt ggt gga tcc GAC ATT CAG ATG AYD CAGTC‑3’；5’‑tct ggc ggc ggc ggc tcc ggt ggt ggt gga tcc GAC ATT GWG CTS ACC CAATC‑3’；5’‑tct ggc ggc ggc ggc tcc ggt ggt ggt gga tcc GAC ATT GTG ATG ACB CAGKC‑3’；5’‑tct ggc ggc ggc ggc tcc ggt ggt ggt gga tcc GAY ATC CAG CTG ACT CAGCC‑3’；5’‑tct ggc ggc ggc ggc tcc ggt ggt ggt gga tcc GAY ATT MAG ATR AMC CAGTC‑3’；5’‑tct ggc ggc ggc ggc tcc ggt ggt ggt gga tcc GAY ATT GTT CTC AWC CAGTC‑3’；5’‑tct ggc ggc ggc ggc tcc ggt ggt ggt gga tcc GAY ATT GTG ATG ACC CAGWT‑3’；含NotI酶切位点的VLF引物：5’‑cag tca ttctgc ggc cgc ACG TTT KAT TTC CAG CTT GG‑3’；5’‑cag tca ttc tgc ggc cgc ACG TTT TAT TTC CAA CTT TG‑3’；含SfiI酶切位点的VH3引物：5’‑tta ctc gcg gcc cag ccg gcc atg gcc GAG GTC CAR CTG CAA CAR TC‑3’；5’‑tta ctc gcg gcc cag ccg gcc atg gcc GAV GTG AWG STG GTG GAGTC‑3’；5’‑tta ctc gcg gcc cag ccg gcc atg gcc GAK GTG CAM CTG GTG GARTC‑3’；5’‑tta ctc gcg gcc cag ccg gcc atg gcc GAA GTG AAR STT GAG GAR TC‑3’；5’‑tta ctc gcg gcc cag ccg gcc atg gcc GAG GTB CAG CTB CAG CAGTC‑3’；5’‑tta ctc gcg gcc cag ccg gcc atg gcc GAG GTG CAR CTT GTT GAR TC‑3’；5’‑tta ctc gcg gcc cag ccg gcc atg gcc CAG GTC CAA CTV CAG CARCC‑3’；5’‑tta crc gcg gcc cag ccg gcc atg gcc GAG GTG AAG GTC ATC GAR TC‑3’；含部分Linker序列的VHF引物：5‑acc gga gcc gcc gcc gcc aga acc acc acc acc CGA GGA GAC TGT GAGAAT GGT‑3’；5‑acc gga gcc gcc gcc gcc aga acc acc acc acc CGC AGA GAC AGT GACCAG AGT‑3’；用于连接片段的PCR鉴定的载体特异性引物：R1：5’‑CCA TGA TTA CGC CAA GCT TTG GAG CC‑3’；R2：5’‑CGA TCT AAA GTT TTG TCG TCT TTC C‑3’；根据设计的多组简并性引物经RT‑PCR法分别扩增抗体重链可变区VH和轻链可变区VL基因；c)分别以所有引物扩增条带的VH和VL合并片段为模板，采用重叠延伸拼接法将二者拼接成ScFv基因，再分别将等量的VHB和VLF各条引物混合并以二者为引物进一步PCR扩增ScFv基因；将构建的ScFv基因片段与pCANTAB5E载体连接与转化。