用功能糖芯片及飞行质谱仪分析糖结合蛋白的方法

摘要

一种用功能糖芯片及飞行质谱仪分析糖结合蛋白的方法，其首先配制偶联剂溶液，孵育固相载体，清洗、干燥后，将还原糖用水溶解，调至所需的浓度，经点样、温育，得功能糖芯片。将生物样品直接加在功能糖芯片上，进行孵育、去除杂质、成形晶体、解离晶体，用飞行质谱仪检测荷电离子在真空电场中飞行的时间，得到蛋白质图谱信息，直观显示被测生物样品中分子量、丰度等蛋白质信息，鉴定蛋白质差异表达。将被测生物样品的蛋白质图谱信息与样本图谱信息进行比照，得到差异表达的糖结合蛋白质信息。本发明解决了背景技术中检测通量低，检测步骤繁琐，周期长的技术问题。本发明操作简便，灵敏度高，重复性好，适合于医学临床的快速分析应用。

主权项

一种用功能糖芯片及飞行质谱仪分析糖结合蛋白的方法，其特征在于，该方法的实现步骤包括：(1)制备功能糖芯片：(1.1)配制偶联剂溶液、孵育固相载体：将偶联剂溶于有机溶剂中，配制成10～50mol/L的偶联剂有机溶液；将衍生化的固相载体浸入偶联剂有机溶液中，室温下孵育3小时；(1.2)清洗：分别用溶解偶联剂的有机溶剂和无水乙醇将固相载体清洗二次；(1.3)干燥：将固相载体于室温干燥；(1.4)将还原糖用水溶解，调至所需的浓度；(1.5)点样：加入pH3～6的酸性点样缓冲液，对固相载体进行点样；(1.6)温育：于25～60℃温育12小时，得功能糖芯片；(2)加载生物样品：(2.1)将生物样品直接加在功能糖芯片上；糖结合蛋白质通过与糖链的特异识别结合到功能糖芯片上，形成特定糖结合蛋白与糖链的复合物；糖链基团以共价偶联方式固定于芯片表面；特定糖结合蛋白与糖链基团通过特异的相互识别和作用，吸附于功能糖芯片上；(2.2)孵育时间0.5‑2小时；(3)去除杂质：用清洗缓冲液清洗，去除功能糖芯片上的非特异结合蛋白质、弱结合蛋白质；(4)成形晶体：加上能量吸收分子或基质，于室温干燥，能量吸收分子或基质与蛋白质结合形成混合晶体；(5)解离晶体：用激光解吸电离的方法使结合在功能糖芯片上的蛋白质解离，形成荷电离子；(6)绘制质谱图：用飞行质谱仪检测荷电离子在真空电场中飞行的时间，得到蛋白质图谱信息，绘制质谱图；(7)鉴定蛋白质差异表达：将被测生物样品的蛋白质图谱信息与样本图谱信息进行比照，得到差异表达的糖结合蛋白质信息；所述的偶联剂是含有一个氨基和一个羟基的偶联剂；所述的衍生化的固相载体是环氧乙烷基团衍生化的固相载体；或者所述的偶联剂是含有一个羧基和一个羟基的偶联剂；所述的衍生化的固相载体是氨基基团衍生化的固相载体；所述的偶联剂有机溶液中加有N‑羟基琥珀酰亚胺和二环己基碳二亚胺，该偶联剂有机溶液中按溶质比例：偶联剂∶N‑羟基琥珀酰亚胺∶二环己基碳二亚胺＝1∶2∶2～4；所述偶联剂被活化的酸基生成活泼酯衍生物。