由启动子调控两种目的基因表达的重组载体

摘要

本发明为由启动子调控两种目的基因表达的重组载体，提高重组载体对肿瘤细胞的钉伤功能。构建方法如下所述：①提取Survivin启动子基因，②提取人的细胞基因mRNA，反转录为cDNA，③在cDNA中扩增第一目的基因，④在cDNA中扩增第二目的基因，⑤将内切酶切开的Survivin启动子基因片断与基本载体分子用连接酶连接成第一中间载体，将内切酶切开的第一目的基因片断与第一中间载体分子用连接酶连接成第二中间载体，将内切酶切开的第二目的基因片断与第二中间载体分子用连接酶连接成第三中间载体，将用内切酶切开的IRES基因片断和第三中间载体用连接酶连接成重组载体，⑥将重组载体转染受体细胞，培养转染后的细胞，使重组载体分子随受体细胞扩增，筛选出含有重组载体分子的受体细胞。提取重组载体，检测其杀伤肿瘤细胞的能力。

主权项

由启动子调控两种目的基因表达的重组载体，其特征在于第一目的基因为颗粒酶B，第二目的基因为Caspase3基因，构建方法如下：(1)Survivin启动子基因提取根据GenBank数据库的Survivin基因启动子序列，合成Survivin基因启动子引物，上游引物：5’‑CAGGTACCGCCATAGAACCA‑3’，下划线处为Kpn I酶切位点，下游引物：5’‑CGGAGCTCCCACCTCTGCCA‑3’，下划线处为Sac I酶切位点，以HepG‑2细胞基因组DNA为模板，PCR扩增Survivin启动子基因片段，(2)细胞总mRNA提取在37℃，5％CO2的培养箱内培养人CD8+细胞，提取细胞总mRNA，(3)活性型颗粒酶B基因提取用TAKARA公司的cDNA合成试剂盒将人CD8+细胞的mRNA逆转录合成cDNA文库，取逆转录产物为模板，PCR扩增颗粒酶B基因序列，上游引物5’‑GCAACGCGTGAGATCATCG‑3’，下划线处为Mlu I酶切位点，下游引物：5’‑CGGCTAGCCTTAGTAGCGTTTC‑3’，下划线处为Nhe I酶切位点，PCR产物用10％琼脂糖凝胶电泳，Qiaquick柱回收试剂盒回收活性型颗粒酶B基因片段，(4)caspase3基因片段提取以人CD8+细胞cDNA为模板，提取caspase‑3基因，上游引物5’‑GCCTCGAGGTATCCATGGAG‑3’，下划线处为Xho I酶切位点，下游引物5’‑CCGTAAGCTTTTCTTTAGTGATAA‑3’，下划线处为HindIII酶切位点，PCR产物用10％琼脂糖凝胶电泳，Qiaquick柱回收试剂盒回收caspase‑3基因片段，(5)质粒制备将Survivin启动子基因片段和PGL‑3Basic质粒用Kpn I与Sac I双酶37℃消化3小时，琼脂糖凝胶电泳，回收片段，取消化后的Survivin启动子基因片段和PGL‑3Basic质粒，以1∶3的比例，在16℃时，用T4DNA连接酶连接16小时，此质粒为PGL3‑Sur‑Luc，以相同方法用Mlu I与Nhe I双酶消化活性型颗粒酶B基因片段和PGL3‑Sur‑Luc，将活性型颗粒酶B基因片段连接到此质粒中，命名为PGL3‑Sur‑颗粒酶B‑Luc，以相同方法用Xho I和HindIII双酶消化caspase3基因片段和PGL3‑Sur‑颗粒酶B‑Luc，将caspase‑3基因片段连接到质粒中，构成PGL3‑Sur‑颗粒酶B‑caspase‑3‑Luc质粒，将该质粒和pIRES‑vector用Nhel和Xmal双酶切，用相同方法将IRES连接至该质粒中，构成PGL3‑Sur‑颗粒酶B‑IRES‑caspase‑3‑Luc质粒，(6)质粒转化及提取将步骤5的最终连接产物转化大肠杆菌Jm109，Vitagene试剂盒抽提质粒DNA，琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性质粒，获得的质粒即为所需重组质粒。