一种利用藻蓝蛋白制备Caspase-3激活肽的方法

摘要

本发明公开了一种利用藻蓝蛋白制备Caspase-3激活肽的方法，旨在提供一种从螺旋藻干粉中提取藻蓝蛋白，利用胰蛋白酶水解藻蓝蛋白，分离得到比藻蓝蛋白本身对Caspase-3酶活力的激活作用更有效，对正常细胞无毒活性的肽的方法。(1)藻蓝蛋白的提取；(2)将得到的藻蓝蛋白粗提液b采用羟基磷灰石柱层析和Sephacryl S-200HR柱层析进行纯化；(3)将纯化后的藻蓝蛋白配成浓度为100μg/mL的溶液，用胰蛋白酶进行酶解处理，酶解温度为40℃，pH值为8.0，酶与底物比为1∶10，反应时间60min；(4)将蓝藻蛋白酶解肽采用DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换柱层析和Sephadex G-25凝胶过滤柱层析分离纯化。

主权项

一种利用藻蓝蛋白制备Caspase‑3激活肽的方法，其特征在于，包括下述步骤：(1)藻蓝蛋白的提取：①细胞破碎：取螺旋藻粉溶于10mmol/L PBS缓冲液中，浸泡4h，于‑20℃‑4℃之间反复冻融4次，每次融化后进行超声破碎，之后，离心，弃沉淀取上清液；其中，每次融化后超声破碎的条件为：超声功率为400w，每超声6s后间隔15s，共进行60次；所述离心的工艺条件为：10000r/min，4℃离心30min；螺旋藻粉的质量为PBS缓冲液体积的10％；②盐析：将上述经过四次冻融四次间歇超声破碎上清液经28％(重量/体积)饱和硫酸铵沉淀，之后离心弃沉淀取上清液；将得到的上清液由55％(重量/体积)饱和硫酸铵沉淀，再次离心取沉淀弃上清液；将沉淀溶于10mmol/LPBS缓冲液中，透析除盐，得到藻蓝蛋白粗提液a；再将得到的藻蓝蛋白粗提液a按照上述步骤进行两次沉淀，两次离心，得到藻蓝蛋白粗提液b；每次离心的条件为：10000r/min，4℃离心30min；(2)藻蓝蛋白的纯化将得到的藻蓝蛋白粗提液b采用羟基磷灰石柱层析和SephacrylS‑200HR柱层析进行纯化；(3)藻蓝蛋白酶解肽的制备将纯化后的藻蓝蛋白配成浓度为100μg/mL的溶液，用胰蛋白酶进行酶解处理，酶解温度为40℃，pH值为8.0，酶与底物比为1∶10，反应时间60min；酶解过程不断搅拌并控制pH值为8.0，以1mmol PMSF终止反应，冻干，得到蓝藻蛋白酶解肽；(4)藻蓝蛋白酶解肽的分离将蓝藻蛋白酶解肽采用DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换柱层析和Sephadex G‑25凝胶过滤柱层析分离纯化；所述DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换柱层析中：平衡液A采用pH值为6.8的20mmol/L PBS缓冲液，平衡液B采用含有1.0mol/L NaCl的pH值为6.8的20mmol/L PBS缓冲液，纯化程序为：用平衡液A平衡层析柱，将酶解后的藻蓝蛋白酶解肽上柱，缓 慢上样，用平衡液A洗脱，待样品完全流穿，再用平衡液A与平衡液B进行线性洗脱，最后用平衡液B洗脱；控制流速，用280nm波长检测流出液洗脱峰，收集含藻蓝蛋白的部分，浓缩后，经Sephadex G‑25凝胶过滤柱层析除盐，将除盐后的产物冻干得到藻蓝蛋白酶解活性肽。