一种镰形扇头蜱的抗凝血分子Rhipilin-1的基因序列和重组表达与应用

摘要

本发明提供了镰形扇头蜱抗凝血分子Rhipilin-1的基因序列及其在大肠杆菌中的重组表达方法。通过构建镰形扇头蜱雌蜱吸血前后的唾液腺消减文库和测序分析，从镰形扇头蜱克隆到一个抗凝血分子Rhipilin-1的全长编码基因，核苷酸全长620bp，开放阅读框编码164个氨基酸残基，预测分子量为18kDa，在N-端有一个18个氨基酸构成的信号肽序列，并含有一个典型的Kunitz功能域，该分子与抗凝血分子之一的组织通道抑制因子显著同源。将该基因亚克隆到pGEX-4T-1表达载体，转化到BL21(DE3)宿主菌中，经IPTG诱导，重组GST融合蛋白以可溶性的形式高效表达。以纯化的重组蛋白进行兔血浆复钙时间和部分凝血酶激活时间实验，证实Rhipilin-1分子具有抗凝血生物活性，可用于制备抗凝血生物制剂。

主权项

一种镰形扇头蜱抗凝血分子Rhipilin‑1基因序列，其特征在于所述基因全长为620bp，在3’端有polyA和polyA的信号序列AATAAA，含有一个完整的开放阅读框，从第43个碱基到536个碱基，编码164个氨基酸，其分子量为18kDa；其编码蛋白在N‑末端有一个18个氨基酸构成的信号肽序列，切割点在第18和第19个氨基酸间：从第84个氨基酸至第139个氨基酸，预测编码一个典型的丝氨酸蛋白酶抑制剂Kunitz功能域；所述镰形扇头蜱抗凝血分子Rhipilin‑1的核苷酸序列和对应的氨基酸序列如下：镰形扇头蜱抗凝血分子Rhipilin‑1的核苷酸序列：aatattggaa aaacttcagc gagcagaaaa caaccaaagg caatgaagat tttacaatac   60gcgctcttgg cttgtcttct cgtctcgata ttaggcgatg atgatgacga agaaaacgag  120ggtgcggcgg ggagtgatga tgcgggcgca acgcctacag cactgtcgaa gccagcagcc  180acttctgcgg aaggaaacac cgcagcaaaa aactcaggtg gtgacatcaa gcaaccgaaa  240caagaactgc ccgaaccgtc ctcaaaaggc caaaagaaac cgagactacc caagagatgc  300ttattcaagc cagaacaggg aaactgcgca ggttctcgtt tccttcctag atggtggtat  360aacccagaaa ctgagagctg cgaaccattc acttatccag tgtgcaataa gaaaaacgaa  420gcattcgtat catgtacact gtgcatgaac atgtgcatga ggaataagag gggcagggag  480aaggctaaat ggattagaaa agtttgtaga aaaagtccga aagtaaaatc tggatgaatg  540tagttggctc tgccacttct tctgccataa aatattcgaa aacatttgtt atgaataata  600 aaattatcaa aaaaaaaaaa                                            620镰形扇头蜱蜱抗凝血分子Rhipilin‑1氨基酸序列：Met Lys Ile Leu Gln Tyr Ala Leu Leu Ala Cys Leu Leu Val Ser Ile1               5                   10                  15Leu Gly Asp Asp Asp Asp Glu Glu Asn Glu Gly Ala Ala Gly Ser Asp            20                  25                  30Asp Ala Gly Ala Thr Pro Thr Ala Leu Ser Lys Pro Ala Ala Thr Ser        35                  40                  45Ala Glu Gly Asn Thr Ala Ala Lys Asn Ser Gly Gly Asp Ile Lys Gln    50                  55                  60Pro Lys Gln Glu Leu Pro Glu Pro Ser Ser Lys Gly Gln Lys Lys Pro65                  70                  75                  80Arg Leu Pro Lys Arg Cys Leu Phe Lys Pro Glu Gln Gly Asn Cys Ala                85                  90                  95Gly Ser Arg Phe Leu Pro Arg Trp Trp Tyr Asn Pro Glu Thr Glu Ser            100                 105                 110Cys Glu Pro Phe Thr Tyr Pro Val Cys Asn Lys Lys Asn Glu Ala Phe        115                 120                 125Val Ser Cys Thr Leu Cys Met Asn Met Cys Met Arg Asn Lys Arg Gly 130                 135                 140Arg Glu Lys Ala Lys Trp Ile Arg Lys Val Cys Arg Lys Ser Pro Lys145                 150                 155                 160Val Lys Ser Gly。