发明名称 |
一种甲型流感病毒甄别与耐药检测基因芯片的制备和用途 |
摘要 |
本发明涉及一种流感病毒甄别与耐药检测基因芯片,其制备方法包括制备通用引物,制备亚型核酸分型探针及耐药探针,制备寡核苷酸芯片,建立RT-PCR体系,建立杂交体系。利用本发明制备的基因芯片可同时甄别5种亚型的甲型流感病毒,包括甲型H1N1、季节性H1N1、季节性H3N2、禽H5N1、猪H1N1流感病毒,并可提示甲型流感病毒达菲耐药情况。该基因芯片具有快速、准确、高通量、特异性高的优势,可为流感病毒的监测、临床诊断及治疗提供指导。 |
申请公布号 |
CN102433391A |
申请公布日期 |
2012.05.02 |
申请号 |
CN201110401595.8 |
申请日期 |
2011.12.06 |
申请人 |
深圳市普瑞康生物技术有限公司;中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所 |
发明人 |
王升启;刘琪琦;陈苏红;张敏丽;刘志红;朱坤 |
分类号 |
C12Q1/70(2006.01)I;C12Q1/68(2006.01)I |
主分类号 |
C12Q1/70(2006.01)I |
代理机构 |
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代理人 |
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主权项 |
1.一种检测甲型流感病毒核酸亚型和耐药性的基因芯片,其制备方法包括:1)步骤一:制备3对通用引物,序列如表1所示:表1引物序列<img file="FSA00000629685400011.GIF" wi="1264" he="591" />2)步骤二:制备10条流感亚型核酸分型探针,序列如表2所示:表2流感亚型核酸分型探针序列<img file="FSA00000629685400012.GIF" wi="1587" he="807" />制备6条耐药检测探针,序列如表3所示:表3耐药检测探针序列<img file="FSA00000629685400013.GIF" wi="1494" he="508" />3)步骤三:将步骤二中的各个寡核苷酸探针用6×SSC,0.1%SDS稀释至终浓度50μM,并点到空白的醛基化修饰玻片上,阵列如表4所示,其中片基质控探针为20T序列,5’端cy3标记、3’端NH2修饰;阴性探针为与病毒无关的植物基因序列;通用序列为甲型流感病毒保守序列;引物1、2、3分别为引物NR21、NR22和NF5的反向互补序列,每条序列3’端NH<sub>2</sub>修饰,所有探针的点样量均为3nl,使用前至少在室温放置干燥18小时;表4寡核苷酸探针阵列<tables num="0001"><table><tgroup cols="8"><colspec colname="c001" colwidth="12%" /><colspec colname="c002" colwidth="12%" /><colspec colname="c003" colwidth="12%" /><colspec colname="c004" colwidth="13%" /><colspec colname="c005" colwidth="12%" /><colspec colname="c006" colwidth="13%" /><colspec colname="c007" colwidth="13%" /><colspec colname="c008" colwidth="13%" /><tbody><row><entry morerows="1"> 片基质控</entry><entry morerows="1"> 引物1</entry><entry morerows="1"> 引物2</entry><entry morerows="1"> 引物3</entry><entry morerows="1"> 通用序列</entry><entry morerows="1"> 阴性探针</entry><entry morerows="1"> 阴性探针</entry><entry morerows="1"> 片基质控</entry></row><row><entry morerows="1"> NEW-1</entry><entry morerows="1"> NEW-2</entry><entry morerows="1"> H1N1-1</entry><entry morerows="1"> H1N1-2</entry><entry morerows="1"> H3N2-1</entry><entry morerows="1"> H3N2-2</entry><entry morerows="1"> AIV-1</entry><entry morerows="1"> AIV-2</entry></row><row><entry morerows="1"> NEW-1</entry><entry morerows="1"> NEW-2</entry><entry morerows="1"> H1N1-1</entry><entry morerows="1"> H1N1-2</entry><entry morerows="1"> H3N2-1</entry><entry morerows="1"> H3N2-2</entry><entry morerows="1"> A1V-1</entry><entry morerows="1"> A1V-2</entry></row><row><entry morerows="1"> NEW-1</entry><entry morerows="1"> NEW-2</entry><entry morerows="1"> H1N1-1</entry><entry morerows="1"> H1N1-2</entry><entry morerows="1"> H3N2-1</entry><entry morerows="1"> H3N2-2</entry><entry morerows="1"> AIV-1</entry><entry morerows="1"> AIV-2</entry></row><row><entry morerows="1"> OSE-1</entry><entry morerows="1"> OSE-2</entry><entry morerows="1"> OSE-3</entry><entry morerows="1"> OSE-4</entry><entry morerows="1"> OSE-5</entry><entry morerows="1"> OSE-6</entry><entry morerows="1"> SIV-1</entry><entry morerows="1"> SIV-2</entry></row><row><entry morerows="1"> OSE-1</entry><entry morerows="1"> OSE-2</entry><entry morerows="1"> OSE-3</entry><entry morerows="1"> OSE-4</entry><entry morerows="1"> OSE-5</entry><entry morerows="1"> OSE-6</entry><entry morerows="1"> SIV-1</entry><entry morerows="1"> SIV-2</entry></row><row><entry morerows="1"> OSE-1</entry><entry morerows="1"> OSE-2</entry><entry morerows="1"> OSE-3</entry><entry morerows="1"> OSE-4</entry><entry morerows="1"> OSE-5</entry><entry morerows="1"> OSE-6</entry><entry morerows="1"> SIV-1</entry><entry morerows="1"> SIV-2</entry></row><row><entry morerows="1"> 片基质控</entry><entry morerows="1"> 阴性探针</entry><entry morerows="1"> 阴性探针</entry><entry morerows="1"> 通用序列</entry><entry morerows="1"> 引物3</entry><entry morerows="1"> 引物2</entry><entry morerows="1"> 引物1</entry><entry morerows="1"> 片基质控</entry></row></tbody></tgroup></table></tables>4)步骤四:制备RT-PCR体系,配方如表5所示:表5R TPCR体系配方<img file="FSA00000629685400021.GIF" wi="1864" he="532" />5)步骤五:制备杂交液,其组成为4×SSC,0.3%SDS,5%甲酰胺,16μM 20T-NH<sub>2</sub>;制备洗液A,其组成为1×SSC,0.2%SDS;制备洗液B,其组成为0.2×SSC;制备洗液C,其组成为0.1×SSC。 |
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