一种苦荞麦叶片的遗传转化方法

摘要

本发明公开了一种苦荞麦叶片的遗传转化方法，该方法包括如下步骤：(1)将发根农杆菌接入YEB培养基中，制备所需的菌液；(2)将苦荞种子接种于不加激素的MS培养基中获得无菌苗；(3)取无菌苗叶片作为外植体，将外植体通过预培养后，浸入已活化的农杆菌菌液中，使外植体与农杆菌充分接触后，取出外植体转入不加激素的MS培养基上进行共培养，最后转接入含有头孢噻肟钠的除菌培养基中进行除菌培养，直到产生大量毛状根。本发明可大大提高毛状根中次生代谢产物的含量。

主权项

一种苦荞麦叶片的遗传转化方法，其特征在于包括如下步骤：菌种的活化培养：将农杆菌划线接种于YEB固体培养基上培养1～2天后，用接种环挑取生长良好的单菌接入YEB液体培养基中震荡培养1～2天至菌液OD600＝0.2～0.6，所述农杆菌为发根农杆菌Ri1601，培养温度为25～30℃；无菌苗的获得：将苦荞种子的种皮剥去，先用75％的酒精消毒30～60s，再用0.1％升汞消毒3～10min，然后用无菌水冲洗2～5次后，接种于不加激素的MS培养基上，在22～28℃、光照强度1000～2000lx，、每天光照8～12h的条件下进行培养；遗传转化培养：选取叶龄在2～30天、生长状况良好的苦荞麦无菌苗叶片作为外植体，先将外植体接种于预培养基MS+2，4‑D 0.5～4mg·L‑1+6‑BA 0.1～1.5mg·L‑1+NAA 0～1mg·L‑1+乙磺酸0～1g·L‑1+蔗糖15～50g·L‑1中进行0～4天的预培养，然后将其取出放入上述制得的农杆菌菌液中浸染2～18min，使外植体与农杆菌充分接触，取出外植体，用无菌滤纸吸干外植体表面多余的菌液，再转入不加激素的MS培养基上进行0～4天的共培养，接着再转入含有头孢噻肟钠200～500mg/L的脱菌水中浸洗2～6min，然后用无菌滤纸吸干脱菌水后，将其转接入除菌培养基MS+头孢噻肟钠300～600mg/L+琼脂6～8g/L+蔗糖15～40g/L中进行除菌培养，每隔5‑7天转接一次，直到产生大量毛状根。