腹水肿瘤细胞致敏DC-CIK的制备方法

摘要

本发明提供了一种腹水肿瘤细胞致敏DC-CIK的制备方法以及DC-CIK的应用。该腹水肿瘤细胞致敏DC-CIK的制备方法包括的步骤有：腹水肿瘤抗原的制备；脐带血单个核细胞的制备；脐带血淋巴细胞和粘附细胞的分离；CIK细胞的诱导扩增；DC细胞的诱导扩增及DC细胞负载腹水肿瘤抗原；DC细胞与CIK细胞共培养制备DC-CIK。本发明腹水肿瘤细胞致敏DC-CIK的制备方法制备的DC-CIK增殖活性和杀瘤活性高，其该方法工序简单，条件易控，对设备要求低。

主权项

一种腹水肿瘤细胞致敏DC‑CIK的制备方法，包括如下步骤：腹水肿瘤抗原的制备：用PBS缓冲液重悬腹水肿瘤细胞，再与终浓度为0.1～1.0mg/ml的亮抑蛋白酶抑制剂混合，形成混合液，置于液氮中5～10min后，接着置入36～38℃水浴中，待混合液完全融化后，再次放入液氮中，反复2～5次，然后依次进行离心，微孔滤膜过滤，得到腹水肿瘤抗原；脐带血单个核细胞的制备：将获取的新鲜脐带血离心后，分别收集上层的脐带血浆和下层的脐带血细胞，将所述脐带血细胞用DPBS缓冲液稀释，再用淋巴细胞分离液分离单个核细胞，用DPBS缓冲液清洗，显微镜下观察计单个核细胞数，最后用淋巴细胞培养液GT‑T551调节单个核细胞密度为1～2×106个/ml，得到单个核细胞悬液，其中，所述淋巴细胞培养液GT‑T551含有体积浓度为1～10％所述脐带血浆；脐带血淋巴细胞和粘附细胞的分离：将所述单个核细胞悬液培养1～1.5小时，然后冲洗细胞，获得没有粘附的细胞和粘附细胞；CIK细胞的诱导扩增：将所述没有粘附的细胞移入含体积浓度1～10％的所述脐带血浆的淋巴细胞培养液GT‑T551中，并加入终浓度为500～1000IU/ml的重组人γ‑干扰素混合，再培养12～36小时后，加入终浓度为50ng/ml～250ng/ml抗胸腺细胞球蛋白、终浓度为0.5～2ng/ml的重组人白细胞介素‑1、终浓度为500～1000IU/ml的重组人白细胞介素‑2进行再次培养7～8天，收集CIK细胞；DC细胞的诱导扩增及DC细胞负载腹水肿瘤抗原：将所述粘附细胞加入DC培养液中培养2～4天后加入终浓度为15～30μg/ml的所述腹水肿瘤抗原继续培养2～4天后，加入终浓度为200～1000ng/ml的肿瘤坏死因子，得到负载肿瘤抗原的DC细胞；DC细胞与CIK细胞共培养制备DC‑CIK：将所述负载肿瘤抗原的DC细胞与所述CIK细胞混合培养，得到腹水肿瘤细胞致敏DC‑CIK。