一种石鲽肝脏细胞系的构建方法

摘要

本发明涉及一种石鲽肝脏细胞系的构建方法，它是以石鲽肝脏组织细胞为材料，采用两步酶消化法启动原代培养，在含胎牛血清、肝细胞生长因子、硫酸软骨素、N-乙酰葡萄糖盐酸盐和石鲽肝脏抽提液的DMEM/F12培养液pH值7.0-7.4中培养；采用胰蛋白酶消化法进行传代培养；本发明工艺科学合理，避免了常规细胞系构建中的酶消化法对石鲽肝脏细胞的损伤，细胞可正常贴壁生长，各培养液添加物有效促进了肝脏细胞的增殖，由本发明构建的石鲽肝脏细胞系目前已传至第110代，细胞增殖状态良好，可望应用该细胞系进行分子细胞水平上多种中草药有效成分对鱼类病毒进行抗病毒作用机理研究，从而研制出病害防治中的有效治疗药物或免疫增强剂，解决日益严重的各种水产养殖病害。

主权项

一种石鲽肝脏细胞系的构建方法，其特征是它包括如下步骤：对鲜活石鲽用75%酒精消毒处理，用纱布擦除体表粘液，置于超净工作台中解剖取下肝脏组织，磷酸盐缓冲液漂洗后粗剪成约50‑100 立方毫米的组织块；进行两步酶消化法后，混合所得细胞悬液；经200目钢网过滤，离心收集后，用含有5%胎牛血清、1‰‑2‰比例的硫酸软骨素和1‰‑2‰比例的N‑乙酰葡萄糖盐酸盐的DMEM/F12培养液充分悬浮，均匀接种于已用0.1%明胶预先铺板的24孔细胞培养板中，22‑24℃下贴壁1小时，每孔再加入1mL石鲽肝脏细胞专用增殖培养液，置22‑24℃生化培养箱中培养，第二天半量更换石鲽肝脏细胞专用增殖培养液一次，待石鲽肝脏细胞长满培养孔后，转至25毫升培养瓶中培养，每隔3‑5天半量更换石鲽肝脏细胞专用增殖培养液一次；待细胞长成单层后，使用浓度为0.125%‑0.25%胰蛋白酶溶液消化，按1瓶传2瓶的方式进行传代培养，并最终建立石鲽肝脏细胞系；所述石鲽肝脏细胞专用增殖培养液配方为含有20%胎牛血清、1‰‑2‰比例的硫酸软骨素和1‰‑2‰比例的N‑乙酰葡萄糖盐酸盐的DMEM/F12培养液pH值7.0‑7.4。