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Procedimiento para la producción de secuencias génicas codificantes de glucosiltransferasas membranales quiméricas que presentan una actividad de glucosilación optimizada en las células transformadas con dichas secuencias, en comparación con la actividad de glucosilación de las glucosiltransferasas nativas correspondientes hacia el sustrato aceptor, siendo dicha actividad de glucosilación optimizada por lo menos 30 veces superior a la actividad inicial de las glucosiltransferasas de longitud completa nativas, comprendiendo dicho procedimiento la fusión: - de un primer ácido nucleico codificante de un fragmento mínimo C-terminal del dominio catalítico (CD) de la glucosiltransferasa de longitud completa nativa, siendo dicha primera secuencia de ácidos nucleicos obtenida mediante la eliminación de nucleótidos codificantes de uno o varios aminoácidos contiguos que se extienden desde el primer aminoácido del extremo N-terminal de dicho CD, y la selección del ácido nucleico codificante de dicho fragmento de CD mínimo C-terminal de manera que si n representa el número de aminoácidos contiguos tal como se ha definido anteriormente, que han sido delecionados, el fragmento obtenido al delecionar por lo menos n+1 aminoácidos contiguos, tal como se ha definido anteriormente, no presenta ninguna actividad sustancial de transferasa, - con un segundo ácido nucleico de secuencia variable codificante de una cadena peptídica transmembranal que especifica el anclaje de las glucosiltransferasas en compartimentos intracelulares, y que comprende en su región Nterminal una región de cola citoplasmática (CT) situada cadena arriba de un dominio transmembranal (TMD) situado cadena arriba de una región de tallo (SR) o de un fragmento de por lo menos 3 aminoácidos contiguos de la SR, estando dicha SR o parte de la misma unida a dicho dominio catalítico mediante un conector o péptido de conexión de por lo menos 2 aminoácidos codificados por un sitio de restricción que no existe en la secuencia de nucleótidos codificante del CD nativo mencionado anteriormente, con la condición de que por lo menos uno de estos péptidos CT, TMD y SR sea diferente de la estructura primaria de las contrapartidas peptídicas naturales presentes en la glucosiltransferasa nativa a partir de la que se obtiene el fragmento de CD con actividad de glucosiltransferasa óptima tal como se ha definido anteriormente, siendo dicha fusión realizada de manera que el primer ácido nucleico se encuentre situado cadena abajo del segundo ácido nucleico y proporcione un producto proteína en el que el CD se encuentre en la mitad C-terminal. |
