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一种卵巢来源雌性生殖干细胞的分离培养方法，其特征在于，包括以下步骤：将成年家畜卵巢的表面上皮层剪碎后置于HBSS液中，依次用IV型胶原酶、胰蛋白酶在37℃孵育消化，待细胞分散开后，加入胎牛血清终止消化，离心去除上清液，用雌性生殖干细胞培养液重悬沉淀物后过滤去掉细胞团，将分离获得的细胞以4～6×102个细胞/mL的浓度接种于含有胎儿成纤维细胞饲养层的培养板中，加入雌性生殖干细胞培养液，于37℃、5％CO2的饱和湿度培养箱中培养；每2～3d更换一次培养液，当培养板铺满单层细胞时，吸弃培养液，加入细胞分离无酶缓冲液，待全部细胞脱壁后，再反复吹吸，使细胞尽量分散；收集细胞悬液，离心去除上清，收集细胞得到雌性生殖干细胞；所述的雌性生殖干细胞培养液是以MEM α‑medium为基础培养基，还包括以下组分：体积分数10～20％的胎牛血清、1～2mmol/L丙酮酸钠、1～2mmol/L非必需氨基酸、2～5mmol/L L‑谷氨酰胺、0.1～1mmol/L β‑巯基乙醇、10～50ng/mL人重组白血病抑制因子、6～10μg/mL胰岛素‑转铁蛋白‑硒钠、10～50ng/mL表皮生长因子、40～100ng/mL胶质细胞源性神经营养因子、1～2ng/mL碱性成纤维细胞生长因子和15～50mg/L青霉素；所述的胎儿成纤维细胞饲养层为：用终浓度为15～20mg/L的丝裂霉素C处理传代培养3代以内的胎儿成纤维细胞2～3h后，再用PBS洗涤胎儿成纤维细胞完全去除丝裂霉素C，然后加入胰蛋白酶液孵育消化，待细胞收缩变圆后终止消化，离心后收集细胞，再用胎儿成纤维细胞培养液重悬细胞；调整细胞密度为2.5～5×105细胞/孔种植于经明胶包被的培养板中，置37℃、5％CO2恒温培养箱培养24h后，作为饲养层细胞；所述的胎儿成纤维细胞培养液是以高糖DMEM为基础培养基，还包括以下组分：体积分数10％的胎牛血清、100IU/mL青霉素、100μg/mL链霉素和1ng/mL碱性成纤维细胞生长因子。 |
