一种检测鸡传染性支气管炎病毒抗体的间接ELISA试剂盒

摘要

本发明公开了一种检测鸡传染性支气管炎病毒抗体的间接ELISA试剂盒。该试剂盒含有IBV-N重组蛋白作为抗原包被的ELISA板。IBV-N重组蛋白通过以下方法获得：根据IBV-N基因序列，设计一对特异引物，然后通过RT-PCR方法对IBV的N基因进行扩增，将N基因定向插入到pET-32a(+)表达载体，筛选获得阳性重组表达质粒pET-32a(+)-IBV-N，并将该质粒转化置BL21感受态细胞，再经ITPG诱导表达，获得IBV-N重组蛋白。该试剂盒成本低廉、操作简便、快速，尤其适合批量样品的检测，大大提高了鸡传染性支气管炎血清学诊断的效率。

主权项

IBV‑N重组蛋白，其特征是，通过以下制备方法获得：1)根据GenBank中已登录的IBV‑N基因序列，设计一对特异引物上游引物为5’‑CCGATATCATGGCAAGCGGTAAAGCA‑3’，下游引物为5’‑CCGTCGACACTCAAAGTTCATTCTCTCC‑3’扩增片段大小为1230bp；2)通过RT‑PCR方法对IBV的N基因进行扩增；以EcoR V和Sal I同时对IBV‑N基因RT‑PCR产物和pET‑32a(+)载体进行酶切，回收目的片段，用T4DNA连接酶将二者进行连接，16℃过夜，次日将连接产物转化感受态细胞BL21，37℃温箱培养16‑20h；挑取单菌落扩大培养，提取质粒，用EcoRV、Sal I进行双酶切鉴定；将阳性重组质粒测序，鉴定正确后获得阳性重组表达质粒pET‑32a(+)‑IBV‑N；3)将阳性重组表达质粒pET‑32a(+)‑IBV‑N及空白载体pET‑32a(+)分别转化BL21感受态细胞，于37℃培养，待OD600nm值达到0.5～0.6时，加入IPTG至终浓度为1.0mmol/L进行诱导表达，收集诱导表达后4h的菌体，超声波破碎，离心后取上清进行SDS‑PAGE电泳和Western blot鉴定；电泳结束后取下凝胶，先用双蒸水洗涤，然后浸入4℃预冷的250mmol/L的KCl溶液中显色5～10min，最后用双蒸水洗涤；将目的蛋白条带切下，PBS洗涤2次，用研钵将其磨碎，反复冻融3次，8000r/min离心10min，吸取上清，SDS‑PAGE电泳进行纯度鉴定。