构建重组杆状病毒的方法

摘要

本发明是一种零背景构建重组杆状病毒的方法。具体步骤为：(1)构建以R6Kγ作为复制子的供体质粒，并按常规方法引入外源基因；(2)封闭DH10Bac宿主菌基因组上的attTn7受体位点，获得DH10BacΔTn7；(3)常规方法转化重组供体质粒进入DH10BacΔTn7获得重组杆状病毒；(4)常规方法制备重组Bacmid DNA转染昆虫细胞。本发明利用以R6Kγ为复制子构建条件限制型供体质粒，同时封闭DH10Bac宿主菌基因组上的attTn7重组位点，只需常规转化即可获得重组杆状病毒，并且由于其超过99％的阳性重组率，无须复杂的PCR验证和繁琐的空斑纯化，做到零背景真正高效快速的构建重组杆状病毒，促进杆状病毒表达系统的广泛利用。

主权项

一种构建重组杆状病毒的方法，其特征在于：该构建方法按下列步骤进行：(1)构建以R6Kγ作为复制子的供体质粒，所述供体质粒为pRCDM，该质粒含有R6Kγ复制子，两个杆状病毒强启动子p10和polh，两个多克隆位点MCS1和MCS2以及转座同源臂Tn7L和Tn7R，按常规方法引入外源基因；(2)封闭E.coli BmDH10Bac宿主菌基因组上的attTn7受体位点，获得BmDH10BacΔTn7；其中封闭宿主菌基因组上的attTn7受体位点的质粒为R6K‑Cm‑Tn7L‑ZeoFRT‑Tn7R，该质粒含有R6Kγ复制子，Tn7‑L和Tn7‑R以及两个抗性筛选标记Zeocin和chloramphenicol，其中，Zeocin抗性基因两侧带有FRT序列；(3)常规方法转化携带外源基因的重组供体质粒pRCDM进入BmDH10BacΔTn7获得含重组Bacmid的阳性克隆；(4)常规方法制备重组Bacmid DNA转染昆虫细胞制备重组杆状病毒。