人源血管紧张素转化酶C-结构域在毕赤酵母中的克隆表达方法

摘要

本发明涉及一种人源血管紧张素转化酶C-结构域在毕赤酵母中的克隆表达方法，PCR扩增人源血管紧张素转化酶C-催化结构域基因片段，克隆至分泌表达载体pPIC9K，转化毕赤酵母GS115，阳性克隆再次电转，用G418筛选高拷贝的酵母菌落进行表达条件优化，获得0.5g/L的蛋白表达量及7.178U/mL的酶活力。经Ni2+亲和层析纯化，获得纯度大于99％的目的蛋白。Captopril对酶的抑制试验证明ACE-C结构域可望成为新一代抗高血压药物ACE抑制剂筛选的理想酶靶。

主权项

一种人源血管紧张素转化酶C‑结构域在毕赤酵母中的克隆表达方法，其特征在于：(1)、表达载体的构建：以质粒GC‑T7349为模板，上下游引物扩增ACE的C‑结构域片段，EcoRI、NotI双酶切，连接入同样双酶切的pPIC9K载体，连接产物转化DH12S，提取阳性转化子的重组质粒pPIC9K‑ACE‑C，进行双酶切、PCR、测序鉴定；(2)、转化酵母细胞及高抗性转化子的筛选：限制性内切酶SacI将测序鉴定正确的高浓度重组质粒线性化，与电转化感受态细胞GS115混合转入0.2cm电转杯，用电转仪电击，参数为：电压1500V；电容25μF；电阻200Ω；电击后，经孵育，涂布于MD平板，30℃培养2天，至单克隆转化子出现，挑取菌落进行PCR鉴定；阳性菌落制备成电转化感受态细胞，进行二次电转，刮下MD平板上生长的菌落分别涂布于含抗生素G4183mg/mL的YPD平板上，30℃培养2～3天，筛选抗性强的转化子；(3)、重组质粒在酵母GS115中的表达：从含3mg/mL G418的YPD平板上挑取单克隆接种于25mlBMGY培养基，30℃培养2天至A600＝2～6，离心收集菌体重新悬浮于200mlBMMY培养基，2mL分装于灭菌试管，添加pH5.5磷酸缓冲液和1.75％甲醇终浓度，30℃诱导96小时，上清做12％SDS‑PAGE、Western Blotting鉴定及Bradford法测定蛋白浓度，薄层凝胶扫描分析蛋白质纯度；(4)、表达蛋白的纯化：甲醇诱导表达的ACE酶分泌到酵母细胞培养基中，96h后收获，培养基离心去除菌体，取上清调pH值至7.4，NaCl浓度至500mmol/L，过Ni2+亲和柱，SDS‑PAGE检测纯化效果；(5)、表达蛋白的活性测定：三肽HHL在ACE的催化作用下快速分解产生马尿酸和二肽His‑Leu，通过HPLC测定马尿酸的生成量来评价ACE的酶活性，0.5mL离心管中加入70μLTris缓冲液、10μL培养基上清于37℃恒温5min，随后加入12.5mmol/L HHL20μL，37℃恒温30min后沸水浴10min，15,000g高速离心10min，转移80μL上清于HPLC管用作进样分析；(6)、血管紧张素转化酶抑制剂Captopril对表达产物ACE C‑端结构域的抑制作用：精密称取2.17mg Captopril，去离子水溶解并定容至10mL容量瓶，即为1mmol/L Captopril母液。稀释母液至102，10，1，10‑1，10‑2，10‑3μmol/L浓度；取10μL与20μL Tris缓冲液、50μL酶液混匀，37℃孵育5min后加20μL HHL启动反应；按步骤(5)方法测定不同浓度的Captopril对ACE‑C结构域的抑制活性；空白对照加10μL去离子水，计算IC50值，即抑制50％ACE‑C结构域酶活性的Captopril浓度；计算公式为Inhibition(％)＝(A‑B)/A×100％A为空白对照组中马尿酸的峰面积(mAU·s)；B为添加抑制样品组中马尿酸的峰面积(mAU·s)。