等位基因的敲除方法及其构建的重组GAL菌株和用途

摘要

本发明公开了一种等位基因的敲除方法，根据等位基因的基因序列，设计40～500bp的同源引物，分三步敲除三个等位基因，同时引入长片段的目的基因。本发明还同时公开了利用上述方法构建而得的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，其保藏名称为：S.CGQ21-14，保藏单位：微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，科学院微生物研究所；保藏日期：2009年9月6日，保藏号：CGMCC NO.3263。该酿酒酵母能在发酵过程中提高GAL1启动子控制下的外源蛋白的表达水平，同时使发酵过程中半乳糖的浓度维持不变。

主权项

一种等位基因的敲除方法，其特征在于：根据等位基因的基因序列，设计40～500bp的同源引物，分三步敲除三个等位基因，同时引入长片段的目的基因；具体包括以下步骤：1)、扩增欲插入到酵母染色体中等位基因位点的目的基因片段和抗性基因片段并按顺序分步克隆到同一个载体中；2)、设计一对同源引物a，以步骤1)中的重组载体为模板扩增得到等位基因敲除片段A；3)、将步骤2)中得到的基因片段A转化酵母，用抗性作为筛选，得到抗性转化子；4)、鉴定转化子：挑取步骤3)中的转化子进行等位基因、插入的目的基因和抗性表达盒的存在情况、引入位点进行分析，挑出目的基因准确插入到等位基因位点的正确转化子；5)、诱导步骤4)得到的正确转化子丢失抗性表达盒，得到第一个等位基因缺失且此等位基因位点处插入目的基因的重组酵母Y1；6)、根据等位基因编码区中距离终止子400～500bp区域的基因序列设计引物，扩增此400～500bp的基因片段，同时扩增抗性基因片段，体外连接两个片段；7)、设计一对同源引物b，以步骤6)中的连接片段为模板扩增得到等位基因敲除片段B；8)、将步骤7)中得到的基因片段B转化步骤5)中得到的酵母Y1，用抗性作为筛选，得到抗性转化子；9)、将步骤8)所得抗性转化子进行鉴定：挑取转化子进行等位基因、插入的目的基因和抗性表达盒的存在情况、引入位点进行分析，挑出正确转化子；10)、诱导步骤9)所得的正确转化子丢失抗性表达盒，得到两个等位基因缺失且一个等位基因位点处插入目的基因的重组酵母Y2；11)、根据等位基因编码区中距离起始密码子300～400bp区域的基因序列设计引物，扩增此300～400bp的基因片段，同时扩增抗性基因片段，体外连接两个片段；12)、设计一对同源引物c，以步骤11)中的连接片段为模板扩增得到等位基因敲除片段C；13)、将步骤12)中得到的基因片段C转化步骤10)中得到的酵母Y2，用抗性作为筛选，得到抗性转化子；14)、将步骤13)所得抗性转化子进行鉴定：挑取转化子进行等位基因、插入的目的基因和抗性表达盒的存在情况、引入位点进行分析，挑出正确转化子；15)、诱导步骤14)所得的正确转化子丢失抗性表达盒，得到三个等位基因被敲除且一个等位基因位点处插入目的基因的重组目的酵母Y3。