乙型肝炎病毒荧光定量PCR检测试剂盒及其应用

摘要

乙型肝炎病毒荧光定量PCR检测试剂盒及其应用，该试剂盒由以下独立存在的组分组成：DNA提取溶液I：含十二烷基硫酸钠0.2％～1.0％(质量/体积)，曲拉通1.0％～4.0％(体积/体积)，异硫氰酸胍0.2mol/L～1.0mol/L；DNA提取溶液II：含4-羟乙基哌嗪乙磺酸100～300mmol/L、pH6.5±0.2，氯化钠100～300mmol/L，磁珠100～400μg/ml；DNA提取溶液III：含曲拉通0.1％～1.0％(体积/体积)、氯化钠100～300mmol/L；DNA提取溶液IV：矿物油；阳性对照内标；PCR反应液；探针HBV-SP；含耐热DNA聚合酶和尿嘧啶DNA糖基化酶的酶混合液；乙型肝炎病毒定量参考品；乙型肝炎病毒阳性对照血清；乙型肝炎病毒阴性对照血清。本发明乙型肝炎病毒荧光定量PCR检测试剂盒可用于检测血清、血浆或乳汁等样本中的HBV-DNA浓度。

主权项

一种乙型肝炎病毒检测试剂盒，其特征在于，由以下独立存在的组分组成：DNA提取溶液I：含十二烷基硫酸钠0.2％～1.0％(质量/体积)，曲拉通1.0％～4.0％(体积/体积)，异硫氰酸胍0.2mol/L～1.0mol/L；DNA提取溶液II：含4-羟乙基哌嗪乙磺酸100～300mmol/L、pH6.5±0.2，氯化钠100～300mmol/L，磁珠100～400μg/ml；DNA提取溶液III：含曲拉通0.1％～1.0％(体积/体积)、氯化钠100～300mmol/L；DNA提取溶液IV：矿物油；阳性对照内标：为插入pUC18T载体的一段长为97碱基对的人工合成DNA序列的重组体，即质粒，浓度为1.00E+03copies/ml～1.00E+06copies/ml；97碱基对的序列如下所示：5’-GTGTCTGCGGCGTTTTATCATCTTCCTCTGTCATCCAGTGCAAGTCTTGATCCTGTCGTTGGTTCTTCTGGACTATCAAGGTATGTTGCCCGTTTGT-3’；PCR反应液：10×PCR反应缓冲液5μl，0.2mmol/L脱氧核糖核苷三磷酸，40mmol/L～200mmol/LROX溶液、0.2μmol/L～0.4μmol/L的用于靶多核苷酸扩增的上下游引物HBV-SF与HBV-SR，0.2μmol/L～0.4μmol/L的用于靶多核苷酸检测的探针HBV-SP，0.1μmol/L～0.2μmol/L的用于检测内标的探针HBVIC-P；所述10×PCR反应缓冲液包括pH7.5的200mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液、30mmol/L氯化镁溶液、500mmol/L氯化钾溶液、0.2％(体积/体积)曲拉通溶液和10％(体积/体积)甲酰胺溶液；所述用于靶多核苷酸扩增的上下游引物及用于靶多核苷酸检测的探针是源于乙肝病毒表面抗原S基因的保守区域的引物和探针，其碱基对序列分别为：上游引物HBV-SF：5’-GTGTCTGCGGCGTTTTATCAT-3’；下游引物HBV-SR：5’-ACAAACGGGCAACATACCTTG-3’；探针HBV-SP：5’-CATCCTGCTGCTATGCCTCATCTTCTT-3’；酶混合液：耐热DNA聚合酶1U/μl～5U/μl，尿嘧啶DNA糖基化酶0.05U/μl～0.2U/μl；乙型肝炎病毒定量参考品：标定已知浓度的含有乙肝病毒的灭活血清，其特征在于该乙型肝炎病毒定量参考品包括A、B、C、D四个浓度组成的梯度参考品，其浓度分别为1.00～5.00E+03IUs/ml(A)、1.00～5.00E+04IUs/ml(B)、1.00～5.00E+05IUs/ml(C)、1.00～5.00E+06IUs/ml(D)；乙型肝炎病毒阳性对照：标定已知浓度的含有乙肝病毒的灭活血清，其浓度为1.00～5.00E+02IUs/ml；乙型肝炎病毒阴性对照：不含有乙肝病毒、丙肝病毒、艾滋病毒及梅毒的灭活阴性血清。