一种检测乙型肝炎病毒P基因YMDD变异的置换扩增法

摘要

本发明涉及“一种检测乙型肝炎病毒P基因YMDD变异的置换扩增法”，其特征在于待测HBV P基因YMDD motif及变异YIDD，YVDD序列通过杂交－连接酶反应置换成指示DNA，再反向扩增指示系统。所述YMDD杂交序列分成左右两半分别加在一段指示DNA首尾两端，加了首尾指示DNA与P基因YMDD区序列杂交，使其首尾靠近契合，杂交链缺口连接酶连接。所述反向扩增指示DNA，采用指示DNA正中间序列作为引物，反向扩增首尾共价相连指示DNA。其缺口两侧碱基匹配依赖性连接使其适合单碱基变异基因分析。一个检测可置换成许多指示PCR，避免仅一套系统扩增产物的再污染。待测RNA也可以杂交－连接反应置换成指示DNA而直接检测。或与SYBR Green染料或荧光分子探针联用还适用于待测基因的实时定量分析。

主权项

1、一种检测乙型肝炎病毒P基因YMDD motif及变异的置换扩增法，其特征在于：将待测P基因RT区DNA/RNA作为保留杂交序列与包括一套以上的指示DNA首尾互补序列杂交，连接酶反应，指示加首尾DNA的首尾共价连接，形成置换指示DNA环，再反向PCR扩增；所述待测P基因RT区包括YMDD、及变异YIDD和YVDD基因的DNA和RNA样本，所述保留杂交序列为待测基因中P基因RT区含变异序列长度为20-100bp序列；从变异基因开始断开形成左、右半部分序列，链长10-50base；所述指示DNA的序列是与HBV基因包括P基因RT区序列无关的基因序列，序列长度为80-1000bp；所述首尾互补杂交序列是指保留杂交序列的右半部分序列加在指示DNA上游首端，左半部分序列反接在指示DNA的下游尾端，形成指示加首尾DNA，所述指示DNA所述连接酶反应包括0℃-20℃连接反应和热循环连接反应；所述反向PCR扩增是采用指示DNA正中间序列的右半部分作为反向引物Rev F，左半部分以互补反义序列作为反向引物Rev R，反向扩增置换指示DNA环。