| 主权项 |
1.一种三维条件下扩增造血干细胞的方法，其特征在于以下步骤：(1)提供滋养细胞：滋养细胞为兔股骨与胫骨骨髓间充质干细胞，以5×105cells·cm-2的密度接种于含20％胎牛血清的DMEM培养基中培养，当细胞在培养瓶底达70％融合时，加入含0.02％EDTA浓度为0.05％的胰蛋白酶消化，按1∶3的比例进行常规传代培养；(2)海藻酸钙微胶珠包埋滋养细胞：采用1.5％海藻酸钠溶液与密度为2.5×105cells·mL-1的滋养细胞悬液以4∶1体积比混合后，经5#针头逐滴滴加至1.5％氯化钙溶液中，反应10分钟，20目筛网过滤制得直径为2毫米的包埋有滋养细胞的海藻酸钙微胶珠；(3)分离人脐带血单个核细胞：脐带血来自健康产妇足月分娩和足月剖腹产婴儿，每次原血采集量平均为50～100mL，密度梯度离心分离得到单个核细胞，用IMDM基础培养基1000rpm，5min离心洗涤两次，调整细胞密度备用；(4)准备旋转壁式生物反应器：旋转壁式生物反应器主要由培养基循环回路和气体循环回路两个循环回路构成；培养基循环回路包括蠕动泵、充氧器、培养室，培养基通过蠕动泵送到充氧器中充氧，之后由生物反应器左端进料口进入培养室为细胞提供养分，氧含量降低了的培养基从生物反应器右端出料口进入蠕动泵，再送入充氧器中充氧，开始下一轮循环；气体循环回路包括CO2 培养箱、气泵、充氧器，CO2培养箱中含5％CO2和95％空气的气体，由气泵送入充氧器中为培养基补充氧，然后返回CO2培养箱中，不断循环；该旋转壁式生物反应器主体部分的充氧器与培养室放置在CO2培养箱外的保温罩中，(5)在旋转壁式生物反应器中，三维悬浮共培养海藻酸钙微胶珠包埋的滋养细胞与造血干细胞：旋转壁式生物反应器培养室的内外筒同方向同角速度旋转，转速从静止逐步增加，经过0rpm一小时、3rpm一小时和5rpm十二小时后，最终达到并保持在6rpm；人脐带血单个核细胞在旋转壁式生物反应器培养室中的接种密度为2～5×105cells·mL-1；(6)分离造血干细胞与微胶珠，收获造血干细胞：采用20目不锈钢筛网截留包埋骨髓间充质干细胞的海藻酸钙微胶珠，收集滤过液——造血干细胞悬液，1000rpm离心5分钟，收获造血干细胞；(7)溶解微胶珠，收获滋养细胞：采用浓度为55mM的柠檬酸钠溶液溶解包埋有滋养细胞的海藻酸钙微胶珠10分钟，1500rpm离心10分钟，收获滋养细胞。 |
