利用液体共培养系统进行根癌农杆菌介导香蕉基因转化方法

摘要

本发明公开了一种利用液体共培养系统进行根癌农杆菌介导香蕉基因转化方法，该方法是将香蕉ECS在根癌农杆菌菌液中黑暗静置一段时间后，于香蕉ECS液体培养基中进行共培养，共培养结束后，把香蕉ECS直接转移到体胚诱导和发育选择培养基上进行培养，将成熟的抗性体胚转移至体胚萌发培养基上，光暗交替条件下培养至体胚萌发得到的小苗，最后将小苗转移至生根筛选培养基上，光暗交替条件下进行培养即获得完整的转化植株。本发明改变共培养条件，解决共培养过程中香蕉ECS的褐化问题；同时缩短了获得香蕉转化植株的周期，由于共培养后的香蕉ECS直接转移到体胚诱导和发育培养基上进行筛选培养，获得转化植株的周期缩短了2～3个月。

主权项

1、一种利用液体共培养系统进行根癌农杆菌介导香蕉基因转化方法，其特征在于包括如下步骤：(1)将导入了质粒的根癌农杆菌于YEB固体培养基上划线，26±1℃，黑暗条件下培养，然后挑取单菌落接种于YEB液体培养基中，26±1℃，振荡培养得到菌液；菌液离心去上清后，用10倍体积的香蕉ECS液体培养基即继代培养培养基重悬菌体，得到工程菌液；(2)取在香蕉ECS液体培养基即继代培养培养基中继代培养3～5天的香蕉ECS，离心去上清后，每0.5ml PCV ECS加入10ml经步骤(1)获得的工程菌液，26±1℃，黑暗静置2～6小时；(3)然后加入香蕉ECS液体培养基即继代培养培养基共培养，所述共培养条件为：26±1℃，黑暗条件下振荡培养，所述振荡培养条件如下：将培养物于90～120rpm转速下振荡培养168～240小时；或者将培养物先在30～50rpm转速下振荡培养10～14小时，然后再提高转速至90～120rpm，继续培养60～156小时；(4)共培养完成后，将培养物静置去上清，用香蕉ECS液体培养基即继代培养培养基将沉淀稀释10倍，然后将悬浮物均匀铺于体胚诱导和发育选择培养基上，26±1℃，黑暗培养3个月，每个月更换一次体胚诱导和发育选择培养基；(5)将成熟的抗性体胚转移至体胚萌发培养基上，光暗交替条件下培养至体胚萌发得到小苗，然后将小苗转移至生根筛选培养基上，光暗交替条件下进行培养即获得完整的转化植株；所述液体培养基组成为：以MS为基本培养基，添加1mgl-1生物素、100mgl-1谷氨酰胺、100mgl-1麦芽提取物、1mgl-12，4-二氯苯氧乙酸和45gl-1蔗糖，高压灭菌前pH为5.3；所述体胚诱导和发育培养基组成为：SH大量元素，SH微量元素，MS维生素，添加1mgl-1生物素，100mgl-1谷氨酰胺，100mgl-1麦芽提取物，230mgl-1脯氨酸，0.2mgl-1萘乙酸，0.1mgl-1激动素，45gl-1蔗糖，10gl-1乳糖，3gl-1 gelrite，500mgl-1先锋霉素和50～100mgl-1的相应的筛选抗生素，高压灭菌前pH为5.3；所述筛选抗生素根据转化质粒上所用的筛选标记基因而定。