巴曲酶基因的合成及其表达产物的纯化制备

摘要

本发明涉及一种基因重组方法制备的巴曲酶(Batroxobin)，其关键是巴曲酶基因的合成、表达以及表达产物的纯化制备和性质确定。这种重组的巴曲酶既可以作为一种止血药的主要成分，也可以直接用作降纤药物。

主权项

1、一种重组巴曲酶，其特征在于：它通过基因工程的方法制成，该方法包括以下几个步骤：(1)、基因合成：按照巴西矛头蛇毒液中巴曲酶的氨基酸序列，选择巴曲酶结构基因所用的密码子，所述的巴曲酶结构基因所用的密码子为酵母或大肠杆菌都比较偏好的密码子，采用人工合成的方法，获得巴曲酶结构基因序列SEQ-2；或采用同样的人工合成的方法，获得完全由甲醇酵母喜好的密码子组成的巴曲酶结构基因序列SEQ-3。(2)、表达载体的构建：在巴曲酶基因的5′-端添加限制酶XhoI的切点，3′-端添加TAATGA双终止密码子及NotI切点，另在XhoI的切点与巴曲酶蛋白N-端第一个氨基酸Val密码子之间加入酵母KEX2蛋白酶识别序列Lys-Arg对应的密码子AAAAGA，将该DNA片段插入pPICZαA或pMETαA载体中，得pPICZαA-Bg或pMETαA-Bg表达载体，克隆，培养，提取质粒；(3)、巴曲酶的表达：用DNA限制内切酶将表达载体pPICZαA-Bg或pMETαA-Bg线性化，制备酵母宿主菌的感受态，并进行电转化；克隆，并进行表达、筛选，得到高表达菌株；(4)、巴曲酶工程菌的上罐发酵及表达产物的纯化。