| 主权项 |
1.一种同步检测多种小分子化合物的试剂的制备方法，其步骤如下：1)制备编码微球试剂(1)制备小分子化合物全抗原：使小分子化合物通过化学反应与牛血清蛋白或卵清蛋白载体进行蛋白偶联，得到小分子化合物全抗原；小分子化合物为孔雀石绿、结晶紫、盐酸克伦特罗、氯霉素、莱克多巴胺、沙丁胺醇、硝基呋喃类兽药代谢物、磺胺、链霉素、甲胺磷、对硫磷、甲萘威、甲霜灵或吗啡之一；用分光光度计测定制备好的小分子化合物全抗原的浓度，用摩尔浓度为0.01M、PH＝7.4的磷酸盐缓冲溶液稀释到质量浓度为1mg/ml；(2)配制磷酸盐-氢氧化钠缓冲溶液：用当量浓度为5N的氢氧化钠水溶液调节摩尔浓度为0.1M的NaH2PO3水溶液的酸度，使pH＝6.0-6.5；(3)微球活化：取1-5μL颗粒直径为3-10μm、荧光颜色为红、橙、黄或绿之一及荧光强度为1至8级之一的聚苯乙烯荧光微球，先放入超声波清洗器中超声30s，然后放入涡旋振荡器中振荡10s，再加入离心管中，再加入200-500μL上述磷酸盐-氢氧化钠缓冲溶液，混合均匀；经3,000rpm离心20分钟，倒掉废液；然后每次用200μL磷酸盐-氢氧化钠缓冲溶液洗涤，洗涤2-3次，；再加入80-300μL上述磷酸盐-氢氧化钠缓冲溶液、5-20μL质量浓度为50mg/ml的NHS和5-20μL质量浓度为50mg/ml的EDC，避光摇振20min；经3,000rpm离心20分钟，倒掉废液；然后每次用200μL摩尔浓度为0.01M、PH＝7.4的PBS洗涤，洗涤2-3次，再溶于50-300μL摩尔浓度为0.01M、PH＝7.4的PBS溶液中，得到活化微球液；(4)小分子化合物全抗原在微球上的固定化：取上述活化微球液80-100μL，加入到离心管中，再加入10-20μL上述制备的质量浓度为1mg/mL的小分子化合物全抗原，避光摇振0.5-2小时，经3,000rpm离心20分钟，倒掉废液；得到已固定化小分子化合物全抗原的微球；(5)配制封闭液：用摩尔浓度为0.01M、PH＝7.4的PBS溶解BSA使其重量百分比浓度为2-10％；再加入NaN3使重量百分比浓度为0.02-0.03％，混合均匀，得到封闭液；(6)已固定化小分子化合物全抗原的微球的封闭：向上述已固定化小分子化合物全抗原的微球中加入200μL上述封闭液，然后放入涡旋振荡器中振荡10s，避光摇振1-2小时，于4℃放置10-15小时，使微球封闭；再每次用100-200μL封闭液洗，洗涤2次，用摩尔浓度为0.01M、PH＝7.4的PBS定容至100-200μL，即制得编码微球试剂；2)制备小分子化合物抗体探针(1)制备荧光量子点抗体探针①基于上述小分子化合物全抗原，对小鼠或大鼠利用杂交瘤技术通过细胞融合，克隆筛选小分子化合物单克隆抗体；或者用制得的小分子化合物全抗原分别免疫兔、羊或鸡，制备筛选特异性好的小分子化合物多克隆抗体；②用硫酸铵分级沉淀法和柱层析分离提纯技术分别对上述小分子化合物单克隆抗体或小分子化合物多克隆抗体进行纯化，用分光光度计测定纯化后小分子化合物单克隆抗体或小分子化合物多克隆抗体的质量浓度；③制备荧光量子点抗体探针：用摩尔浓度为0.1M、pH＝7.4的Na3PO4溶液溶解上述纯化后的小分子化合物单克隆抗体或小分子化合物多克隆抗体，使其质量浓度为10mg/mL，得到小分子化合物抗体溶液；取2mL小分子化合物抗体溶液，加入在水相合成的摩尔浓度为0.00125mol/L CdTe量子点溶液0.5-2mL，混合均匀后，再加入质量浓度为0.6mg/ml的EDC1mL，将反应体系用摩尔浓度为0.01M、PH＝7.4的Na3PO4溶液补足至5mL，室温下避光反应2h；在4℃条件下，用400mL摩尔浓度为0.01M的Na3PO4、摩尔浓度为0.15M的NaCl、pH 7.4的透析液对反应液进行透析，透析袋截流量为10000-30000，每6h换一次透析液，共计30h；得到荧光量子点抗体探针；(2)制备荧光量子点二抗探针：用抗小鼠、大鼠、兔、羊或鸡之一IgG抗体替换上述小分子化合物的单克隆抗体或小分子化合物的特异性好的多克隆抗体，其余步骤按制备荧光量子点抗体探针的步骤操作，即可制得荧光量子点二抗探针；(3)制备荧光染料抗体探针：PE或FITC荧光染料对上述小分子化合物的单克隆抗体或小分子化合物的特异性好的多克隆抗体，进行标记，标记步骤如下：①抗体、PE或FITC的预处理：a.将上述5mg小分子化合物的单克隆抗体或小分子化合物的特异性好的多克隆抗体每次用400ml含质量百分比浓度为0.05％的NaN3，pH7.2、摩尔浓度为10mM的PBS缓冲液进行透析，透析3-4次，其间更换缓冲液，每次透析时间为3-4小时，最后一次透析过夜；b.将5mg PE或FITC每次用400ml含摩尔浓度为50mM的NaH2PO4、摩尔浓度为2mM的EDTA、pH 7.0缓冲液进行透析，透析3-4次，其间更换缓冲液，每次透析时间为3-4小时，最后一次透析过夜；c.上述透析后的抗体、PE或FITC分别经10,000rpm，4℃离心10分钟去除沉淀；用分光光度计分别测定抗体、PE或FITC的质量浓度；②PE或FITC的衍生化a.取Sephadex G-25层析柱，用5倍柱床体积含摩尔浓度为50mM的MES、摩尔浓度为2mM的EDTA、pH 6.0的交换缓冲液平衡；b.按照每mg上述经透析PE或FITC中加入10-13μL的摩尔浓度为10mg/mL的SMCC的DMSO溶液的比例加入SMCC，室温避光摇振反应60min；加入平衡后的Sephadex G-25层析柱中去除游离的SMCC，收集PE或FITC，得到衍生化的PE或FITC；用分光光度计测定衍生化的PE或FITC质量浓度；③抗体的还原a.ephadex G-25层析柱用5倍柱床体积含摩尔浓度为50mM的MES、摩尔浓度为2mM的EDTA、pH 6.0的交换缓冲液平衡；b.按照每mL上述经透析的抗体溶液中加入20μL的摩尔浓度为1M的DTT的比例加入DTT，室温避光摇振反应30min；加入平衡后的Sephadex G-25层析柱中去除游离的DTT，收集抗体部分，得到还原后的抗体；用分光光度计测定抗体质量浓度；④PE或FITC和抗体的共价交联a.将上述还原后的抗体按照1个IgG分子结合1-3个PE或FITC分子的比例逐滴加入到上述衍生化的PE或FITC中，边加边搅动；室温避光振荡反应2小时；得到PE-抗体或FITC-抗体；用分光光度计测定PE-抗体或FITC-抗体质量浓度；b.向每mg上述PE-抗体或FITC-抗体中加入0.34μL摩尔浓度为10mg/mL的NEM的DMSO溶液的比例加入NEM进行封闭，室温避光摇振反应20min；然后置蛋白截流量为30,000的浓缩器中浓缩；浓缩比为3-4∶1；⑤凝胶分离纯化a.Sephacryl S-300层析柱用5倍柱床体积含摩尔浓度为10mM的PBS、摩尔浓度为1M的Urea尿素、质量百分比浓度为0.05％的NaN3、pH7.2缓冲液平衡，其中柱体包裹锡箔纸进行避光；b.利用经缓冲液平衡的Sephacryl S-300层析柱对上述浓缩后的PE-抗体或FITC-抗体进行纯化，根据洗脱曲线收集合格的标记产品，得到纯化后的PE-抗体或FITC-抗体；c.将上述纯化后的PE-抗体或FITC-抗体分别每次用400ml含质量百分比浓度为0.05％的NaN3、pH7.4、摩尔浓度为100mM的PBS缓冲液进行透析，透析3-4次，其间更换缓冲液，每次透析时间为3-4小时，最后一次透析过夜；然后置蛋白截流量为30,000的浓缩器中浓缩；浓缩比为3-4∶1，得到纯化后的PE-抗体或FITC-抗体的浓缩液；d.将上述纯化后的PE-抗体或FITC-抗体的浓缩液分别经10,000rpm，4℃离心10分钟去除沉淀，制得PE-抗体探针和FITC-抗体探针；(4)制备荧光染料二抗探针：用抗小鼠、大鼠、兔、羊或鸡之一IgG抗体替小分子化合物的单克隆抗体或特异性好的多克隆抗体，其余步骤按制备荧光染料抗体探针中步骤进行操作，即可制得荧光染料二抗探针。 |
