花鲈胚胎干细胞移植制备嵌合体的方法

摘要

一种花鲈胚胎干细胞移植制备嵌合体的方法，其操作程序是：花鲈囊胚(约1000个细胞)作受体、以稳定表达绿色荧光蛋白(GFP)的花鲈胚胎干细胞(LJES1细胞)为供体，通过显微注射方法将20－50个供体细胞移植到受体囊胚中，无菌海水培养移植胚胎，孵化鱼苗用新鲜海水培养，在荧光显微镜下(激发波长488nm)观察到表达GFP的胚胎和鱼苗即为嵌合体。应用本方法制备的嵌合体其成功率、成活率和孵化率分别为58％、56％和79％，明显高于受体具有相同特性的金鲷的44％、43％和42％，充分证明本发明在技术上更适于海水鱼类细胞移植和嵌合体制备，具有更强的实用性。

主权项

1、一种花鲈胚胎干细胞移植制备嵌合体的方法，它的操作程序是：受体-囊胚期胚胎的准备、供体细胞的制备、应用显微注射技术进行细胞移植制备嵌合体、嵌合体胚胎和鱼苗的检测、培养，其特征在于：所述的供体细胞的制备：供体细胞为稳定表达绿色荧光蛋白的花鲈胚胎干细胞LJES1，采用4ul脂质体介导法将1ug线性化pCMVEGFP质粒转化至生长状态良好的LJES1细胞内，转化前一天，用完全培养基以15×104/ml细胞接种1ml到每个12孔细胞培养板中，使细胞70％-80％长满；转化后培养6小时后，更换新鲜的完全培养基，继续培养48小时，在荧光显微镜下可检测到绿色荧光在细胞中表达，以含0.6ug-0.8ug/ml嘌呤霉素的培养基筛选3-4个星期，得到稳定表达绿色荧光蛋白的LJES1细胞克隆；扩大培养，细胞移植前收集细胞，加入TM溶液，制成单细胞悬液作为细胞移植的供体；所述的应用显微注射技术进行细胞移植制备嵌合体：进行细胞移植和嵌合体的制备使用显微注射方法；用长而相对柔软的拨卵针，拨动单排直线排列在特制的琼脂凹槽中的受体囊胚，使动物极移至上方；同时用显微注射针吸取上述20-50个供体细胞注射到受体囊胚中，全部操作在解剖镜下进行。