生长抑素全合成新方法

摘要

本发明属生物技术领域，本发明公开了生长抑素(14肽)的固相合成新方法。本方法采用2－氯三苯甲基树脂作固相载体，在该树脂首先连接保护半胱氨酰基(Fmoc－Cys(Trt)－)，采用Fmoc保护氨基酸的程序接肽法完成生长抑素线肽的合成，用三氟醋酸一次脱除线肽侧链保护基团，并切割树脂，得到生长抑素线肽的三氟醋酸。该中间产物在双氧水或二甲基亚砜水溶液中氧化环合，得到生长抑素三氟醋酸盐粗制品。该粗制品经C₁₈键合硅胶中压柱，用甲醇－水梯度洗脱方法分离纯化，得生长抑素三氟醋酸精制产品。该产品用醋酸离子交换树指交换，并冷冻干燥得最终产品。本方法制备生长抑素具有产率高，合成快，不易消旋，可分子内选择性氧化环合，纯度好，方法简便等优点。可用于大批量生产制备。

主权项

1.一种生长抑素全合成方法，其特征在于该方法包括下列步骤： I.程序反应 生长抑素线肽合成采用程序反应，步骤如下： 步骤 溶剂(或试剂) 用量(ml/g) 次数 时间(分钟/次) 备注 1 二氯甲烷 5-7 2 2 1，2交替洗 2 甲醇 5-7 2 2 3 20％哌啶/DMF 10 2 20 4 二氯甲烷 5-7 3 2 4，5交替洗 5 甲醇 5-7 3 2 6 加入1-3当量Fmoc保护氨基酸，1-3 当量HOBt，用二氯甲烷溶解，若难溶，加少许 DMF，而后加入1-3当量1mol/lDCC/DCM，机 械搅拌。 1 4小时 7 二氯甲烷 5-7 3 2 7，8交替洗 8 甲醇 5-7 3 2 II.切割反应 合成生长抑素树脂线肽采用K试剂切割，方法如下： 将K试剂加入到树脂中(约10ml-30ml/g树脂)，树脂立即变为 紫红色，冰水浴下机械搅拌反应5小时后，过滤，并用K试剂洗 涤树脂，加入大量冷乙醚，即析出大量白色固体，过滤，收集白 色固体，K试剂由三氟乙酸、苯甲硫醚、乙二硫醇、苯酚、水组 成；余渣用10％醋酸洗涤后，合并，冷冻干燥得线肽； III.氧化环合与纯化工艺 对得到的线形肽按照1mg/1.5ml的浓度进行室温氧化环合，氧化 溶剂为0.01-1％双氧水或0.15％二甲亚砜/水；≥5小时后，氧化环 合完全；直接上C₁₈填料的中压色谱柱，5-500mg/g填料；先用蒸馏水 将双氧水或二甲亚砜从色谱柱上洗脱，然后用0-80％MeOH/H₂O： 0.1-10％AcOH将产品从色谱柱洗脱，浓缩后，冷冻干燥，一次性可得 到除去双氧水或二甲亚砜的产品，提高纯度，按一定梯度 (MeOH/H₂O/AcOH体系)进行二次纯化，冷冻干燥得纯化产品； 反应式： 试剂 投料量 摩尔数 0.1％H₂O₂或5％DMSO/H₂O 2520ml 线肽 1.68g 操作方法： 将线肽1.68g投入2520m15％DMSO/H₂O溶液中，振荡溶解后，室 温放置24小时(避光)后点样，展开剂：n-BuOH∶AcOH∶Py∶H₂O＝9∶ 2∶3∶4 氧化环合完全后直接上样 得：分离： 除双氧水或二甲亚砜 试剂 投料量 生长抑素粗品水溶液 2520ml 80％MeOH/H₂O 3000ml 蒸馏水 约2000ml 装置： 操作方法： (1)将生长抑素/DMSO/H₂O溶液上柱 (2)用蒸馏水进行洗脱，直至将DMSO除去 (3)用80％MeOH/H₂O：1mlAcOH进行洗脱 (4)收集洗脱液，浓缩冷冻干燥 (5)得生长抑素粗品1.44g 纯化 试剂 投料量 生长抑素粗品 1.44g H₂O 15ml MeOH/H₂O：AcOH 梯度洗脱 装置：C₁₈制备柱(22×300mm) 操作：(1)生长抑素粗品用15ml水溶解后上柱； (2)收集洗脱液； (3)浓缩，冷冻干燥； (4)其他低于98％洗脱液合并，冷冻干燥，重新纯化； (5)得生长抑素，TFA白色固体560mg。 RP-CC纯化条件：洗脱液A：0.2％AcOH/MeOH 洗脱液B：0.2％AcOH/H₂O层析柱：C18制备柱(22×300mm) 洗脱梯度时间(分) 100％B 100ml 50 0-20％A 各100ml 100 20％-30％A 各100ml 100 30％-40％A 各100ml 100 40％-60％A 各100ml 100 60％-100％A 各100ml 100 流速2ml/min 紫外检测波长220nm IV.交换反应(醋酸生长抑素制备) 投料量 试剂 投料量 生长抑素TFA盐 560mg 10％醋酸 10ml 装置：离子交换树脂柱(25×300mm) 操作： (1)将生长抑素三氟醋酸盐溶于10％醋酸中 (2)将此溶液加入到盛有强碱性离子交换树脂柱上(25×300mm) (3)用10％醋酸水溶液洗脱样品 (4)收集洗脱液 (5)用茚三酮显色反应进行跟踪 (6)合并样品洗脱液 (7)浓缩、冷冻干燥得醋酸生长抑素白色固体450mg。