蓝藻转基因表达系统及其用于表达胸腺素α<SUB>1</SUB>的方法

摘要

涉及一种蓝藻转基因表达系统及表达外源基因的方法，构建了包含蓝藻热休克基因groESL强启动区、目的基因UBTα₁、rbcS终止区和Km标记基因的完整的可高效表达的蓝藻基因表达系统，并运用基因整合平台系统和穿梭质粒系统进行转基因表达胸腺素α₁，由于利用热休克基因groESL的强启动子，易调控，经热诱导后能几十上百倍地加快转录，同时利用泛素融合技术，使目的基因Tα₁得到高效表达，转化藻的藻株中UBTα₁的表达量分别达到17.6％和10％，且工艺简单、成本低。

主权项

1.热休克诱导外源基因高效表达的蓝藻转基因表达系统，其特征在于根据蓝藻Synechococcus sp.PCC7942的groESL操纵子中ATG上游240bp片段两端的序列设计一对引物P1、P2：P1 5′端引物：5′-TCGCGAGCTCGACAACTGTC-3′ SacIP2 3′端引物：5′-CCGCATGCTTTTGAGTAAACGTCGTCACGG-3′ SphIP2的5′端设计了一个SphI酶切位点，其切点为GCATG↓C；以蓝藻Synechococcus sp.PCC7942基因组DNA为模板，以p1和p2引物进行特异性PCR扩增得含groESL启动区的PCR扩增片段；用HindIII酶切质粒pKYLX-71-35S，电泳回收4.9kb片段，与经同样酶切的pUC19连接重组，连接物转化E.coli JM101，以氨卞青霉素和卡那霉素筛选得重组质粒pUCMT1’；根据胸腺素α1基因片段两端的序列设计PCR引物T1、T2和T2’：T1 5′端引物：5’-GGGCATGCAAGGATCCGACGCAGCT SphI BamHIGTTGACACCAGCTCCGAAATCACCACCAAAGACTTAAAGG-3’T2 3′端引物：5’-GGGTCGACTAGTTTTCTGCTTCTTCA SalI SpeIACAACTTCTTTTTTTTCCTTTAAGTCTTTGGTGGTGATT-3’T2’3′端引物：5’-GGGTCGACTAGTTTTCTGCTTCTTC-3’ SalI SpeI以常规PCR扩增法进行扩增后得110bp的Tα1 DNA片段；运用pUC18多克隆位点两端的通用引物U1和U2：U1 5′端引物：5’-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’U2 3′端引物：5’-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3’以质粒pUCUB为模板，按常规PCR方法扩增出含UB基因的328bp的DNA片段：纯化UBDNA片段和Tα1 DNA片段，用BamHI同时酶切，然后用T4DNA连接酶连接，以连接产物为模板，以U1和T2’为引物进行特异性扩增，得380bp的UBTα1 DNA片段；用SphI同时单酶切groESL启动区的PCR扩增片段和UBTα1 DNA片段，连接后以连接物为模板，P1、T2’为引物按常规PCR法扩增后得ESL-UBTα1片段，将ESL-UBTα1片段插入到质粒pUCMT1’的SacI-XbaI位点之间，连接物转化受体菌E.coli JM101，在具有Ap与Km的培养基上筛选出双抗的克隆子，获得包含热休克基因groESL的强启动区、目的基因UBTα1，终止区以及Km标记基因的蓝藻的完整表达载体质粒pEUTMT1。