治疗乙肝病毒感染的靶向核糖核酸酶的制备工艺

摘要

本发明公开了一种治疗乙肝病毒感染的靶向核糖核酸酶的制备工艺,它通过分子生物学的手段,构建人嗜酸性粒细胞来源的神经毒素hEDN与HBV多聚酶末端蛋白结构域DNAPTP或核心蛋白的融合蛋白,该融合蛋白即为构建的靶向核糖核酸酶,本融合蛋白可以采取基因治疗或蛋白质药物的方式,治疗人的乙肝病毒的感染。实验表明,本发明构建的靶向核糖核酸酶在体外可使乙肝表面抗原(HBSAg)下降46%－59%,可以明显抑制乙肝病毒的复制。具体的给药途径和给药方式可参照目前已有的基因治疗或蛋白质药物的方案。

主权项

1、一种治疗乙肝病毒感染的靶向核糖核酸酶的制备工艺，其特征在于： 1)hEDN编码基因的扩增及测序 1.1根据hEDN基因序列进行引物设计 正向引物：5′-GCGCGGATCCACCATGAAACCTCCACAGTTTAC-3′； 反向引物：5′-GCGCGAGCTCGATGATTCTATCCAGGTG-3′； 正向引物及反向引物的5′端分别带有BamHI和SacI酶切位点； 1.2扩增目的基因 在5×10⁶～10×10⁶的HL-60细胞中加入1ml的Trizol^，反复吹打，在15 ℃～30℃下放置5分钟，然后加入0.2ml的氯仿，剧烈震动15秒，在15℃～ 30℃下放置2-3分钟后在2℃--8℃、12000g的相对离心力下离心15分钟，吸 取上层水相； 在上层水相中加入0.5ml的异丙醇，在15℃～30℃下放置10分钟后在2 ℃～8℃、12000g的相对离心力下离心10分钟，去上清，得到HL-60细胞的总 RNA； 应用OneStepRNAPCRkit试剂盒，在每个PCR聚合酶链式反应管中加 入5μl的10×OneStepRNAPCRBuffer、10μl浓度为25mmol/L的MgCl₂、 5μl浓度为10mmol/L的dNTP、1μl的RNaseInhibitor、1μl的AMVReverse TranscriptaseXL、1μl的AMV-optimizedTaq、1μl正向引物、1μl的反 向引物、1μl的模板RNA和24μl的无RNA酶的纯水混合后，分别置于50℃ 下30min反应一次、94℃下2min反应一次，然后再置于94℃下30s、55-65 ℃下30s、72℃延伸1-10min分别循环25-40次； 2)HBVc编码基因的扩增及测序 2.1根据HBVc编码基因的基因序列进行引物设计 正向引物：5′-GCGCGAGCTCATGGACATCGACCCTTAT-3′； 反向引物：5′-GCGCAAGCTTTTAACATTGAGGTTCCCGAGA-3′； 正向引物及反向引物的5′端分别带有SacI和HindIII酶切位点； 2.2扩增目的基因 向2.2.15细胞加入1ml/10cm²的Trizol^，在15℃～30℃下放置5分钟后， 加入0.2ml/1mlTrizol^的氯仿，剧烈震动15秒，再在15-30℃下放置2-3分 钟后，在2℃～8℃、12000g的相对离心力下离心15分钟，吸取上层水相； 在上层水相中加入0.5ml/1mlTrizol^的异丙醇，15-30℃下放置10分钟， 2℃～8℃、12000g的相对离心力下离心10分钟，去上清，得到2.2.15细胞 的总RNA； 应用OneStepRNAPCRkit试剂盒，在每个PCR聚合酶链式反应管中加 入5μl的10×OneStepRNAPCRBuffer、10μl浓度为25mmol/L的MgCl₂、 5μl浓度为10mmol/L的dNTP、1μl的RNaseInhibitor、1μl的AMVReverse TranscriptaseXL、1μl的AMV-optimizedTaq、1μl正向引物、1μl的反 向引物、1μl的模板RNA和24μl的无RNA酶的纯水混合后，置于50℃下30 min、94℃下2min反应一次，然后再置于94℃下30s、55-65℃下30s、72℃ 延伸1-10min分别循环25-40次，得到PCR产物； 2.3克隆与测序 将hEDN和HBVc的产物PCR经1.0-1.5％琼脂糖凝胶电泳后用NucleoTrap^NucleicAcidPurificationKit试剂盒，进行纯化回收； 将回收产物分别用BamHI和SacI、SacI和HindIII酶切后纯化回收， 分别与用BamHI和SacI及SacI和HindIII酶切后纯化回收的pUC18连接； 连接产物转化大肠杆菌JM109株，以HighPurePlasmidIsolationKit试剂 盒，提取质粒，再用BamHI和SacI及SacI和HindIII酶切鉴定； 序列测定采用双脱氧链末端终止法，以ABI377DNA自动序列测定仪进行； 2.4靶向核糖核酸酶真核表达载体构建 将扩增的hEDN及HBVc编码基因分别用BamHI和SacI、SacI和HindIII 双酶切，将真核表达载体经BamHI和HindIII双酶切后，以T4连接酶连接hEDN、 HBVc、pcDNA3.1(-)酶切片段，转化E.coliJM109感受态细胞； 用含Amp的固体培养基(LB)筛选阳性克隆，经小量提取质粒，并酶切鉴 定后，构建融合真核表达载体pcDNA3.1(-)/hEDN-HBVc； 2.5带有柔性的(Gly₄Ser)₃连接区的靶向核糖核酸酶真核表达载体构建 2.5.1柔性连接区编码基因的合成首先合成两条互补的寡核苷酸链，序列 如下： P15’gcgcggatccggtggcggtggctcgggcggtggtgggtcgggtggc ggcggatctgagctcgcgc3’ P25’gcgcgagctcagatccgccgccacccgacccaccaccgcccgagcc accgccaccggatccgcgc3’ 将上述两条寡核苷酸链以无菌双蒸水稀释至浓度为40μmmol/L，各取15 μL混匀后，分别置于94℃下5分钟使两条寡核苷酸链变性，再分别置于80 ℃下5分钟、75℃下5分钟、70℃下5分钟、65℃下5分钟、60℃下5分钟、 55℃下10分钟使两条寡核苷酸链复性； 将复性后的产物经1.5-2％琼脂糖凝胶电泳后纯化回收，即为柔性连接区 编码基因； 2.5.2带有柔性的(Gly₄Ser)₃连接区的靶向核糖核酸酶真核表达载体构建 将融合真核表达载体pcDNA3.1(-)/hEDN-HBVc经BamI和SacI双酶切 后形成的大片断命名为p/HBV； 将纯化回收的p/HBV与经BamHI和SacI双酶切的经变性、复性后的两 条寡核苷酸链柔性连接区编码基因以T4连接酶连接，形成重组质粒p/LHBV； 将p/LHBV以BamHI酶切，Klenow补平，HindIII酶切后，纯化回收小 片断LHBV； 融合真核表达载体pcDNA3.1(-)/hEDN-HBVc经SacI酶切，T4DNA多聚酶 削平，HindIII酶切后，纯化回收大片断p/hEDN； 将LHBV和p/hEDN以T4连接酶连接，转化E.coliJM109感受态细胞； 用含Amp的固体培养基(LB)筛选阳性克隆，经小量提取质粒，并酶切鉴定后， 构建带有柔性的(Gly₄Ser)₃连接区的靶向核糖核酸酶真核表达载体p/LTR。