抗菌肽啤酒酵母的制备与应用

摘要

柞蚕抗菌肽具有广谱杀菌作用。根据天然抗菌肽A的1－11位氨基酸序列及抗菌肽D的12－37位氨基酸序列,设计抗菌肽AD基因,克隆于啤酒酵母中表达。经优化培养基配方和培养条件,在发酵罐中达到高密度培养及高效表达(5000单位/毫升)。将抗菌肽酵母制品按5000单位/kg添加于仔猪饲料中,或以60－100单位/日·头添加于雏鸡饮水中,能预防与治疗禽畜腹泻,可代替部分抗生素作为饲料添加剂。

主权项

1、抗菌肽啤酒酵母的制备，其特征在于根据柞蚕天然抗菌肽基因设计抗菌肽AD氨基酸序列及其基因 BamHⅠ M K W K L F K K I E K V G5′GGATCCGT ATG AAA TGG AAG TTG TTC AAA AAG ATT GAA AAG GTT GGT3′CCTAGGCA TAC TTT ACC TTC AAC AAG TTT TTC TAA CTT TTC CAA CCA F1 Q R V R D A V I S A G P A V A--------------------------------------------→CAA AGA GTT AGA GAC GCT GTC ATC TCT GCT GGT CCT GCT GTT GCCGTT TCT CAA TCT CTG CGA CAG TAG AGA CGA CCA GGA CGA CAA CGG ←------------------------------------- F2 T V A Q A T A L A KACT GTT GCT CAA GCT ACT GCC TTG GCT AAG TAATAAGAATTCGTCGAC 3′TGA CAA CGA GTT CGA TGA CGG AAC CGA TTC ATTATTCTTAAGCAGCTG 5′ EcoRⅠ SalⅠ用DNA合成仪合成含82个碱基的F1多聚脱氧核糖核苷酸片段和含78碱基F2多聚脱氧核糖核苷酸片段，它们之间有20个碱基互补；设计合成引物1:5′GGATCCGTATGAAATGGAAG 3′ 引物2:3′TCATTATTCTTAAGCAGGCTG 5′通过F1、F2和引物1、2，用PCR(聚合酶链反应)方法合成具有134个碱基对的抗菌肽AD基因；将抗菌肽AD基因与pCRTM2.1质粒(T载体)用T4DNA连接酶连接构建成pCRCAD重组质粒；用pCRCAD重组质粒转化大肠杆菌JM109，用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)和溴氯吲哚半乳糖苷(X-gal)筛选获得含pCRCAD重组质粒pCRCAD的转化子；用限制性核酸内切酶BamHⅠ和SalⅠ酶切得到抗菌肽AD基因(cecropin ADgene)片段，该基因片段具有134碱基(bp)；将抗菌肽AD基因片段与穿梭质粒pCLWA2用T4DNA连接酶连接构建成含抗菌肽AD基因的重组表达质粒pCAD；用锂盐法将重组表达质粒转化于亮氨酸缺陷型啤酒酵母AB103：用缺亮氨酸培养基筛选抗菌肽AD酵母工程菌株；将抗菌肽AD酵母工程菌株在培养基培养得到抗菌肽AD酵母制品。