ENSAYO DE ACTIVACION DEL RECEPTOR QUINASA.

摘要

SE INVENTA UN ENSAYO PARA MEDIR LA ACTIVACION (EJ.: AUTOFOSFORILACION) DE UN RECEPTOR DE TIROSINA QUINASA, DE INTERES. A) UNA PRIMERA FASE SOLIDA ESTA CUBIERTA CON UNA POBLACION, CONSIDERABLEMENTE HOMOGENEA, DE CELULAS, DE MANERA QUE ESTAS SE ADHIEREN A LA PRIMERA FASE SOLIDA. LAS CELULAS TIENEN, BIEN UN RECEPTOR DE TIROSINA QUINASA ENDOGENO O HAN SIDO TRANSFORMADAS CON UN RECEPTORTOR CON CODIFICACION DE ADN O "CONSTRUCCION DE RECEPTOR" Y EL ADN SE HA EXPRESADO DE MANERA QUE EL RECEPTOR O CONSTRUCCION DEL RECEPTOR SE PRESENTA EN LAS MEMBRANAS CELULARES DE LAS CELULAS. B) UN LIGANTE SE AÑADE ENTONCES A LA FASE SOLIDA CON LAS CELULAS ADHERIDAS, DE MANERA QUE EL RECEPTOR DE TIROSINA QUINASA ESTA EXPUESTO AL LIGANTE. C) DESPUES DE LA EXPOSICION AL LIGANTE, LAS CELULAS ADHERENTES SE SOLUBILIZAN, LIBERANDO ASI LISADO DE CELULA. D) UNA SEGUNDA FASE SOLIDA ESTA CUBIERTA CON UN AGENTE CAPTOR QUE QUE SE FIJA CONCRETAMENTE AL RECEPTOR DE TIROSINA QUINASA O, EN EL CASO DE UNA CONSTRUCCION DE RECEPTOR,AL POLIPEPTIDO INDICADOR. E) EL LISADO DE CELULA OBTENIDO EN EL PASO C) SE AÑADE A LOS POZOS QUE CONTIENEN EL AGENTE CAPTOR ADHERENTE, PARA CAPTAR EL RECEPTOR O CONSTRUCCION DE RECEPTOR EN LOS POZOS. F) DESPUES SE LLEVA A CABO UN PASO DE LAVADO, PARA ELIMINAR EL LISADO DE CELULA NO FIJADO, DEJANDO EL RECEPTOR CAPTURADO O CONSTRUCCION DE RECEPTOR. G) EL RECEPTOR CAPTURADO O CONSTRUCCION DE RECEPTOR SE EXPONE A UN ANTICUERPO ETIQUETADO DE ANTI-FOSFOTIROSINA, QUE DEFINE RESIDUOS FOSFORILADOS EN EL RECEPTOR DE TIROSINA QUINASA. H) SE MIDE LA FIJACION DEL ANTICUERPO DE ANTI-FOSFOTIROSINA AL RECEPTOR CAPTURADO O CONSTRUCCION DE RECEPTOR.