乙酰乳酸合成酶抑制剂筛选方法和应用

摘要

本发明涉及乙酰乳酸合成酶(ALS酶)抑制剂筛选方法和应用。被筛选物参与试管中的ALS酶的酶促反应，如果它是该酶抑制剂，则反应速率下降，产物减少，通过测定反应产物的转化物，快速准确地得出酶的活性和化合物的抑制活性，从而实现ALS酶抑制剂的筛选。提出了新的空白概念和最佳的pH范围，建立了四种溶剂体系，可溶解各类送检样本，检测了各类化合物及其衍生物，发现了开发高效除草剂的先导化合物，给出了ALS酶抑制中浓度IC₅₀值。

主权项

1.乙酰乳酸合成酶(ALS酶)抑制剂筛选方法，其特征在于：选用质量与数量相同的乙酰乳酸合成酶做酶促反应的催化剂，酶促反应的反应物由乙酰乳酸合成酶的底物，辅酶，和缓冲液配制而成，反应过程为：测定反应体系中不含被筛选物的酶促反应速率V0和反应体系中加入被筛选物后的，被抑制的酶促反应速率V1，根据二者比值，确定抑制活性百分数i％，其公式为：$i\%=(1-\frac{V1}{V0})\times 100\%---\left(1\right)$ 反应速率V可用测定酶活即随时间而变化的产物的增加量代表，用E表示，则公式(1)成为：$i\%=(1-\frac{E1}{E0})\times 100\%---\left(2\right)$ 根据测定的E值，计算出被筛选物的抑制活性i％，根据抑制活性i％判断是否为抑制剂及抑制剂的优劣，就可筛选出抑制剂，其筛选过程包括以下步骤：(1).首先选用质量与数量相同的乙酰乳酸合成酶做酶促反应的催化剂；(2).确定能完全溶解被筛选物的一种溶剂，并配制其溶液；(3).确定进行酶促反应的反应物中底物，辅酶，和缓冲溶液的组成及浓度；(4).在有酶，水，和缓冲溶液配成的反应液中，再按以下四种情况(I，II，III，IV)加入不同的物质进行酶促反应，分别测出四种情况下的产物量E值；在反应液中加入溶解被筛选物的溶剂而不加被筛选物时：I.测定反应液中不含反应物时的酶促反应空白产物量EA；II.测定反应液中加入反应物后的酶促反应产物量EB；在反应液中加入被筛选物溶液后：III.测定反应液中不含反应物时的酶促反应空白产物量EA1；IV.测定反应液中加入反应物后的酶促反应产物量EB1；(5).确定乙酰乳酸合成酶的活性E0，该活性等于加入反应物后的酶促反应产物量EB与没有反应物时的酶促反应产物量EA之差，该值表达式： E0＝EB－EA(6).确定乙酰乳酸合成酶在有被筛选物存在时的残余活性E1.该值表达式： E1＝EB1-EA1(7).根据权利要求1中的公式(2)，计算被筛选物的抑制活性。