农药倍硫磷残留免疫检测方法

摘要

本发明涉及农药倍硫磷残留免疫检测方法，属于生物技术领域。农药倍硫磷残留ELISA检测方法中，以“倍硫磷－牛血清白蛋白偶联物”作为免疫原制备倍硫磷抗血清即倍硫磷多克隆抗体，其检测方程为Logit(B/Bo)＝－0.7575LogC－1.4928(其中B为样品孔吸光值，Bo为阳性对照吸光值，C为板孔中测出的倍硫磷浓度)，检测条件为：倍硫磷包被抗原“倍硫磷－卵清蛋白偶联物”1.2μg/ml在微量分析板中每孔加50μl，倍硫磷抗血清稀释16000倍作为工作浓度，1％明胶作封闭物，抗原抗体反应液磷酸盐－吐温缓冲液中甲醇含量为5％、pH值为7.4、离子强度为0.15mol/L。本方法具较强的特异性、灵敏性及稳定性，为倍硫磷超微量检测提供了快速、灵敏、准确的技术方法。

主权项

1、农药倍硫磷残留量的免疫检测方法，包括：(1)倍硫磷多克隆抗体制备采用倍硫磷人工抗原的免疫原“倍硫磷-牛血清白蛋白偶联物”，常规免疫方法免疫新西兰白兔，制备得到抗倍硫磷的兔抗血清即为倍硫磷多克隆抗体；(2)包被采用倍硫磷人工抗原的包被抗原“倍硫磷-卵清蛋白偶联物”1.2μg/mL在微量分析板中每孔加50μL，4℃冰箱过夜，倒净，以常规洗涤缓冲液磷酸盐-吐温缓冲液洗涤3～6次并倒置、在吸水纸上拍干；(3)封闭1％明胶作封闭物，微量分析板每孔100μL，37℃反应1小时，倒净，以常规洗涤缓冲液磷酸盐-吐温缓冲液洗涤3～6次并倒置、在吸水纸上拍干；(4)加抗体及抗体与待测样品的混合液用稀释8000倍的倍硫磷抗血清与待测样品和空白抗原抗体反应液磷酸盐-吐温缓冲液等体积充分混合，后以每孔50μl加到微量分析板中，37℃反应1小时，倒净，以常规洗涤缓冲液磷酸盐-吐温缓冲液洗涤3～6次并倒置、在吸水纸上拍干；(5)加酶标二抗用pH7.4、0.15mol/L的常规洗涤缓冲液磷酸盐-吐温缓冲液将商品化的HRP-羊抗兔IgG稀释2000倍，微量分析板每孔加50μL，37℃反应1小时，倒净，以常规洗涤缓冲液磷酸盐-吐温缓冲液洗涤3～6次并倒置、在吸水纸上拍干；(6)显色微量分析板每孔加50μL的四甲基联苯胺底物溶液，37℃显色反应10分钟(7)终止反应并读数加2mol/L的硫酸，微量分析板每孔加25μL终止显色反应，酶联仪上450nm处读出吸光值，空白基质作阳性对照吸光值Bo，待测样品吸光值B；(8)数据处理计算出结合率B/Bo及Logit(B/Bo)，Logit(B/Bo)＝Ln[(B/Bo)/(1-B/Bo)] 公式1代入如下检测方程(公式2可由倍硫磷标准系列浓度的竞争曲线进行校正。)：Logit(B/Bo)＝-0.7575LogC-1.4928 公式2其中C为微量分析板孔中测得的倍硫磷浓度，通过公式1和公式2可以求得；X＝n×2C，n为反应前样品被稀释的倍数 公式3通过公式3求得待测样品中以浓度X表示的倍硫磷残留量。